Генетика, геномика и генная инженерия бактерийНИР

Genetic, genomics and genetic engineering of bacteria

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий
Результаты этапа: Для изучения регуляции фотосинтетического транспорта электронов у цианобактерий сконструированы мутанты цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, лишенные оранжевого каротиноидного белка (OCP), необходимого для нефотохимического тушения флуоресценции (NPQ) в фикобилисомах при избыточном освещении. С помощью мутанта Docp изучено влияние активации ОСР на активность Фотосистемы II. Для выяснения взаимосвязи между NPQ и переходными состояниями фотосинтетического аппарата мутация Docp введена в геном штамма Synechocystis PCC 6803, лишенного флавопротеинов Flv1/Flv3, акцептирующего электроны от Фотосистемы I при освещении адаптированных к темноте клеток. Показано влияние ОСР на способность мутанта Dflv1/flv3 осуществлять переход состояний при высокой интенсивности света. Сформирована коллекция азотфиксирующих гетероцистных цианобактерий порядка Nostocales, включающая 17 независимых изолятов модельного штамма Trichormus variabilis, порядка 75 новых природных свободноживущих или ассоциативных штаммов Anabaena, Nostoc, Cylindrospermum, Calothrix, Tolypothrix, выделенных в различных экотопах из различных регионов мира (Подмосковье, Якутия, Коми, Норильск,Украина, Белое море), а также около 24 изолятов цианобактерий Nostoc, Halotia, Cylindrospermum из образцов гиполитного слоя грунта из экстремальной зоны обитания (Антарктида, Оазис Лансерманна). 2. Проведена таксономическая идентификация большинства штаммов коллекции и отобраны новые штаммы-изоляты, перспективные с точки зрения их использования в генетических экспериментах по получению мутантов с повышенным уровнем выделения водорода и продукции стимуляторов роста растений. 3. Завершена работа по полногеномному секвенированию и биоинформатической обработке полученных данных для двух новых штаммов Trichormus variabilis с депонированием результатов секвенирования в базу GenBank. Продолжена работа по выяснению роли регуляторных генов pchR1, pchR2, pchR3 и furA в гомеостазе железа и, в частности, в контроле транспорта в клетку дигидроксаматных ксеносидерофоров у модельной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Гены pchR1, pchR2 и pchR3 Synechocystis 6803 кодируют AraC-подобные регуляторы транскрипции, гомологичные белку PchR AraC-семейства, который регулирует экспрессию генов систем синтеза и транспорта сидерофора пиохелина у почвенной бактерии Pseudomonas aeruginosa. Эти три гена локализуются в уникальном кластере генома Synechocystis 6803, содержащем структурные гены потенциальных компонентов систем транспорта ксеносидерофоров, включая ранее идентифицированные нами гены системы транспорта дигидроксаматных ксеносидерофоров шизокинина и SAV (сидерофор Anabaena variabilis). На предыдущем этапе исследования нами было показано, что гены pchR1, pchR2 и pchR3 функционально избыточны и вовлечены во взаимную негативную регуляцию. Более того, зависимая от pchR1 и стимулируемая SAV позитивная регуляция генов, кодирующих компоненты системы транспорта дигидроксаматных ксеносидерофоров, подвержена негативному влиянию генов pchR2 и pchR3. Ген furA Synechocystis 6803 кодирует ортолог глобальных регуляторов гомеостаза железа у различных бактерий (белки Fur). Согласно данным биоинформатического анализа, ген furA может быть вовлечен в регуляцию экспрессии генов систем транспорта железа, а также генов pchR1, pchR2 и pchR3 в клетках Synechocystis 6803. Однако функциональный анализ гена furA существенно осложнен тем, что он является жизненно важным, и поэтому все известные попытки его инактивации с получением полностью сегрегированного мутанта (Synechocystis 6803 содержит до 200 копий генома) оказались безуспешными.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий
Результаты этапа: В плане исследования генетического контроля и регуляции процесса фотосинтеза сконструированы двойные мутанты Synechocystis sp. PCC6803, лишенные флавопротеина Flv1 и оранжевого каротиноидного белка (OCP) или белка ApcD, необходимого для перехода состояний фотосинтетического аппарата, а также тройной мутант, лишенный всех трех компонентов. Показано, что при освещении адаптированных к темноте клеток цианобактерии ОСР-зависимое нефотохимическое тушение флуоресценции фикобилисом и переход состояний начинаются одновременно с активацией фотосистемы II и происходят независимо друг от друга. В плане исследования генетического контроля гомеостаза железа нами было продолжено ду исследование роли регуляторного гена furA , продукт которого белок FurA является глобальным регулятором гомеостаза железа у различных бактерий. В качестве объекта в нашем исследовании используется модельная одноклеточная цианобактерия Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis).Данные проведенного биоинформатического анализа указывают на возможное вовлечение гена furA в регуляцию экспрессии генов систем транспорта железа у Synechocystis. Наиболее простой подход для выявления функции гена заключается в полной инактивации гена и изучении фенотипа полученного мутанта.. Инактивация гена furA летальна для клетки, как было нами установлено. Этот ген является является жизненно важным для Synechocystis. Таким образом, функциональный анализ гена furA с помощью описанного подхода невозможен.Мы пошли по пути получения условно летального мутанта ΔfurA Synechocystis. С этой целью сконструировали рекомбинантную плазмиду с клонированным геном furA под контролем промотора гена coaT Synechocystis, позитивно регулируемого геном coaR, эффектором которого являются ионы кобальта в среде роста. Плазмиду ввели в мутант ΔfurA Synechocystis и получили рекомбинантный штамм ΔfurA, содержащий автономную плазмиду с дополнительной функциональной копией гена furA под контролем регулируемого кобальтом промотора. Клетки Synechocystis содержат до 200 копий генома, поэтому сегрегацию рекомбинантного штамма ΔfurA проводили на среде с кобальтом и контролировали степень сегрегации с помощью полимеразной цепной реакции. После многократных последовательных пересевов рекомбинантного штамма ΔfurA на агаризованной среде с кобальтом был отобран мутант, у которого инактивированы все хромосомные копии гена furA. Предварительный анализ показал, что отобранный мутант характеризуется существенно сниженной скоростью роста в среде без кобальта и пониженным содержанием хлорофилла в фотосистеме. Проведена первичная таксономическая идентфикация для большинства новых штаммов из коллекции азотфиксирующих цианобактерий, которая включает свободноживущие цианобактерии из различных регионов и экотопов (Подмосковье, Антарктида, Байкал, Бурятия, Украина), а также образующие ассоциации с растениями мхов из различных регионов России (Подмосковье, Якутия, Коми). Морфологические и генетические данные по последовательности генов 16S рРНК показывают, что новые изоляты цианобактерий могут быть отнесены к родам Nostoc, Anabaena, Trichormus, Cylindrospermum, Tolypothrix, Calothrix, Halotia и др. порядка Nostocales. В коллекции новых изолятов цианобактерий порядка Nostocales были отобраны ассоциативные штаммы из олиготрофных экосистем, способные к миксотрофному и гетеротрофному росту, как наиболее перспективные для оценки влияния цианобактериальной инокуляции на рост растений в лабораторных тест-системах. В этих экспериментах совместно с кафедрой микологии и альгологии было показано, что несколько штаммов Nostoc и Trichormus способны эффективно стимулировать рост растений риса при их совместном культивировании. Наиболее перспективными в этом отношении являются новые изоляты цианобактерии Trichormus variabilis, выделенные как ассоциативные из проб растений мхов Marchantia polymorpha, Dicranum scopаrium, Polytrichum strictum и Sanionia uncinata, В нашей лаборатории штамм Trichormus variabilis АТСС 29413 является модельным штаммом при создании мутантов - продуцентов аммония, молекулярного водорода и биологически активных веществ. Мутантные штаммы с дерепрессированным процессом азотфиксации способны стимулировать рост растений и полученный эффект может быть связан с повышенным уровнем продукции аммония и ауксино- и гибберелино-подобных веществ. Для оценки генетических различий четырех новых штаммов-изолятов Trichormus variabilis и модельного штамма Trichormus variabilis АТСС 29413 было проведено полногеномное секвенирование совместно с Институтом общей генетики РАН, результаты которого в настоящее время анализируются.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий
Результаты этапа: С целью изучения регуляции фотосинтетического и дыхательного транспорта электронов у цианобактерий были сконструированы двойные мутанты Synechocystis sp. PCC6803, лишенные флавопротеинов Flv1/Flv3, а также комплекса NDH1 или растворимой НАД(Ф)Н:хинон-оксидоредуктазы (DrgA). Сконструированные мутанты используются для изучения роли белка DrgA в дыхании и в фотоактивации электронного транспорта в тилакоидной мембране цианобактерий. Исследованы возможности использования рамановской спектроскопии для идентификации отдельных структурных компонентов клеток цианобактерий. С помощью мутантов Synechocystis sp. PCC6803, лишенных отдельных компонентов фикобилисом, в спектрах, полученных при возбуждении в диапазоне ближнего инфракрасного света выявлены пики, соответствующие компонентам фикобилисом (фикоцианину и аллофикоцианину), а также каротиноидам. Проведена работа по точной генетической идентификации 20 новых штаммов Nostoc, Trichormus на основе секвенирования генов 16S риб-РНК. Определение скорости роста культур новых изолятов в фототрофных и гетеротрофных условиях позволило выделить группу штаммов, которые обладают наибольшим потенциалом в экспериментах по изучению влияния цианобактерий на рост растений в модельных экспериментах. Разработаны простые тест-системы для анализа процесса взаимодействия (ассоциации) клеток цианобактерий с корнями модельных растений риса и др и стимуляции роста растений в жидкой и агаризованной средах. Завершен анализ результатов полногеномного секвенирования нового штамма Trichormus variabilis МР21-1, выделенного из ассоциации с мхом Dicranum scoparium в Московской области. По сравнению с модельным штаммом Trichormus variabilis ATCC 29413 данный штамм характеризуется повышенной способностью к конъюгативному переносу рекомбинантных плазмид и был использован в экспериментах по получению инсерционных водород-продуцирующих мутантов. Методом генетической инженерии получены селективно-поддерживаемые инсерционные мутанты по генам HupL и HypF у штаммов Trichormus variabilis ATCC 29413 и МР21-1, способные к продукции молекулярного водорода/ Для оценки роли гена furA в регуляции транспорта сидерофоров у цианобактерии Synechocystis, проведен сравнительный анализ транскрипции 4 генов транспорта шизокинина tonB, exbB1, exbD1 и schT в клетках мутанта ΔfurA и штамма дикого типа в условиях подавления экспрессии гена furA (в отсутствии кобальта в среде). Продукты этих 4 генов входят в состав белкового комплекса, обеспечивающего транспорт сидерофоров через наружную мембрану клетки. Согласно экспериментальны данным, в отсутствии кобальта мутантный штамм ΔfurA демонстрирует пятикратное снижение экспрессии гена furA относительно штамма дикого типа. Установлено, что в этих условиях у мутанта ΔfurA существенно повышена экспрессия генов транспорта шизокинина tonB, exbB1, exbD1 и schT (в 11, 20, 15 и 8 раз, соответственно). Это указывает на то, что транскрипция этих генов репрессируется белком FurA в присутствии ионов железа в среде роста.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий
Результаты этапа: Сконструирован мутант flv3/drgA цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803, у которого отсутствует комплекс флавопротеинов Flv1/Flv3 и растворимая NAD(P)H:хинон-оксидоредуктаза (DrgA). Кинетика светоиндуцированного фотосинтетического транспорта электронов через фотосистему I в клетках мутанта свидетельствует об участии дегидрогеназы DrgA в переносе электронов от NADPH в пул пластохинона тилакоидной мембраны цианобактерии. Мутанты Synechocystis sp. PCC6803, лишенные отдельных компонентов фикобилисом изучены с помощью метода Рамановской спектроскопии. В спектрах комбинационного рассеяния идентифицированы и картированы пики, соответствующие фикоцианину, аллофикоцианину и каротиноидам. Завершено исследование генетического контроля транспорта органического железа у модельной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. проведен функциональный анализ роли гена furA, потенциального глобального регулятора гомеостаза железа у Synechocystis. Согласно данным биоинформатического анализа, возможными генами-мишенями белка-регулятора FurA могут быть 8 генов (tonB, exbB1, exbD1, schT, fecB1, fecC, fecD и fecE), кодирующих компоненты системы транспорта ксенсидерофора шизокинина (бактериального хелатора железа, чужеродного для Synechocystis) в цитоплазму клетки через наружную мембрану, периплазму и внутреннюю мембрану. Нами показано, что все 8 генов, указанных выше, входят в состав furA-регулона и контролируют путь транспорта ксеносидерофора Fe-шизокинина в клетку Synechocystis. Проведена генетическая идентификация штаммов из коллекции природных изолятов азотфиксирующих нитчатых цианобактерий целью отбора новых штаммов с высокой скоростью роста и перспективных в дальнейших экспериментах по генетической инженерии, изучена их способность к генетическому обмену. На модельном объекте Trichormus variabilis ATCC 29413 методом генетической инженерии получены селективно-поддерживаемые инсерционные мутанты по генам HupL и HypF способные к эффективной продукции молекулярного водорода. Сходные мутанты получены на другом штамме Trichormus variabilis МР21-1, выделенном из ассоциации со мхом Dicranum scoparium в Московской области. Проводятся заключительные эксперименты по получению двойных мутантов HupL HypF и сравнительный анализ уровней выделения водорода культурами инсерционных мутантов и ранее выделенных в лаборатории мутантов РК17 и РК84-продуцентов водорода.
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Генетика, геномика и генная инженерия бактерий
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".