ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Представляемый проект посвящён комплексному исследованию состава, структуры и значения микобиоты морского бентоса и оценке влияния нефтяного загрязнения на сообщества донных мицелиальных и дрожжевых грибов и грибоподобных страминопил в морях Российской Арктики. Акватории морей Северного Ледовитого океана, несмотря на огромное значение для природы и экономики России и мира в целом, пока остаются относительно слабоизученными по многим аспектам. В частности, сведения о составе и структуре такого важного для большинства исследованных экосистем эукариотного сапротрофного компонента – микобиоты в широком смысле, включающей грибы и грибоподобные организмы, для арктических морей фрагментарны и зачастую уже устарели. В настоящее время экосистемы Арктики испытывают постоянно возрастающую нагрузку со стороны человека, одним из важнейших факторов которой является нефтяное загрязнение. Именно сапротрофный блок, включая его грибной компонент, представляет собой главный механизм устойчивости экосистемы к поллютантам. В ходе реализации проекта, для выявления значения исследуемых организмов, впервые будет дана максимально полная, комплексная характеристика разнообразия грибов и грибоподобных страминопил морей Российской Арктики. Будут исследованы изменения в структуре микобиоты при нефтяном загрязнении. Для многих районов такие сведения даже об отдельных группах исследуемых организмов будут получены впервые. С помощью широкого спектра методов, включающих культуральные, прямые микроскопические и молекулярные (в том числе метагеномный анализ) впервые будет проведено комплексное исследование микобиоты ненарушенных и загрязнённых экотопов. Это даст как наиболее полное представление о сообществах грибов и грибоподобных, так и возможность сравнения результатов, получаемых при использовании различных методических подходов. Будет исследована способность выделенных культур к развитию и сохранению в экстремальных арктических условиях: особенности прорастания и сохранения жизнеспособности спор и роста колоний. Испытания будут проведены в модельных условиях лабораторных культур и специально разработанных экспериментальных установок в природе. Будет проведена оценка роста выделенных культур на углеводородах нефти с целью поиска штаммов с высоким биоремедиационным потенциалом. Изменения, происходящие в структуре микобиоты при нефтяном загрязнении будут оценены в серии экспериментов в условиях морского аквариума по оригинальной методике.
This project is devoted to a comprehensive study of the diversity, structure and significance of the marine benthic mycobiota and assessment of the effect of oil pollution on the communities of bottom mycelial fungi, yeasts and fungi-like straminopiles in the Russian Arctic seas. The Arctic Ocean, despite the great importance for the nature and economy of Russia and the world as whole, still remain relatively poorly studied in many aspects. Particularly, information on the composition and structure of an eukaryotic saprotrophic component, which is important for the majority studied ecosystems – mycobiota in wide extend, including fungi and fungi-like organisms – are fragmented and often already outdate for the Arctic seas. Currently, the arctic ecosystems era experienced an ever-increasing pressure from man, one of the most important factors of which is oil pollution. It is the saprotrophic block, including its fungal components, that represents the main mechanism of ecosystem resistance to pollutants. During the implementation of the project, in order to identify the significance of the studied organisma, for the first time, the fullest, most comprehensive description of the diversity of fungi and fungi-like straminopiles of the Russian Arctic seas will be given. Changes in the structure of mycobiota during oil pollution will be investigated. For many regions, such information, even about individual groups of the studied organisms, will be obtained for the first time. Using a wide range of methods, including cultural, microscopic and molecular, a comprehensive study of the mycobiota of the natural and polluted ecotopes will be carried out for the first time. This will give both the most complete information of thr communities of fungi and fungi-like organisms, as well as the possibility of comparing the results obtained using various methodological approaches. The ability of the isolated cultures to develop and preserve in extreme arctic conditions will be investigated (the characteristics of germination and preservation of viability of spores and colony growth). Tests will be carried out in model conditions of laboratory cultures and specially designed experimental facilities in natural ecotopes. The growth of isolated cultures on hydrocarbons will be assessed to search for strains with high bioremediation potential. Changes in teh mycobiota structure during oil pollution will be evaluated in experiment in marine aquarium using the original method.
Учитывая специфику микологических исследований, длительность многих процедур, и, зачастую, непредсказуемость по времени и результату, а также начало многих работ только в летнем полевом сезоне 2020 года, научные результаты за этот год будут носить в основном предварительный характер. Будет составлена коллекция культур неясного таксономического положения, выделенных из различных районов Северного Ледовитого океана, по которой уже точно можно будет судить о численности и обилии данных культур в различных образцах. Будет начата обработка посева из Баренцева моря, выделены культуры, проведена первичная морфолого-культуральная идентификация, что даст предварительные сведения о разнообразии грибов и грибоподобных в ненарушенных и антропогенно-загрязнённых локациях побережья Северного Ледовитого океана. Кроме того, можно будет судить об общей численности и соотношении грибов и грибоподобных в посевах. В то же время мы планируем полностью закончить работы по исследованию структуры грибной биомассы в этих же грунтах, включая обсчёт данных. Таким образом, к концу года мы будем иметь окончательные данные о содержании биомассы в этих грунтах. Осенью 2020 года будет закончена первая серия эксперимента по выживаемости спор грибов при замораживании. Результаты по этому этапу также будут готовы к концу года: мы будем знать процент спор, выживающих и способных прорасти после заморозки в течение полугода. В 2020 году мы планируем подготовить и сдать в печать рукопись по материалам с литорали Новой Земли. Материалы для метагеномного анализа будут подготовлены к осени 2020 года и сданы на анализ.
Участники коллектива в течение нескольких последних лет проводят работы по исследованию микобиоты арктических и субарктических морей. Авторами получены данные о видовом составе грибов в донных грунтах Белого, Баренцева, Карского и Чукотского морей; о разнообразии грибов, ассоциированных с бурыми водорослями-макрофитами субарктического Белого моря. С частью образцов, по которым мы планируем проводить исследования в рамках проекта, в настоящее время уже начаты работы. Проведены работы по исследованию микобиоты ненарушенных верховых болот северной подзоны тайги и переходных водоёмов побережья Белого моря. Все эти работы основывались на использовании культуральных методов, в которых авторы являются квалифицированными специалистами. Авторы проекта имеют опыт в микроскопических исследованиях биомассы грибов в морских грунтах, умеют выделять из грибов ДНК, готовить материал для секвенирования и анализировать полученные результаты. В ходе предыдущих работ с арктическими морскими грунтами были подобраны оптимальные условия культивирования таких образцов. Работы с грибоподобными организмами начаты участниками летом 2019 года, но уже определены методические особенности в таких работах. Работы с дрожжевыми грибами проводятся в сотрудничестве с коллегами – специалистами по данной группе. Авторами были разработаны и уже использовались схемы тестирования культур, в частности – тесты на прорастание спор, а также экспериментальная установка и схема опытов по прорастанию спор в условиях природного экотопа. Участники коллектива владеют техникой подводных погружений, необходимой для отбора проб и проведения экспериментов в природной среде. Члены коллектива публикуют свои работы в профильных российских и иностранных журналах; участвуют с устными и стендовыми докладами в российских и международных конференциях. За время работы членами коллектива успешно реализованы проекты РФФИ, в том числе в качестве руководителей, а также РНФ.
Важнейшие результаты, в соответствии с поставленными задачами: 1) Определить видовой состав и таксономическую структуру комплексов грибов и грибоподобных организмов в ненарушенных и загрязнённых нефтью локациях отдельных морей Российской Арктики По данной задаче первым значимым, на наш взгляд, результатом, является то, что грибы, способные к разложению углеводородов, были обнаружены в грунтах, в разной степени, загрязнённых углеводородами, в том числе, и относительно чистых. При этом, сообщества углеводородокисляющих грибов во всех случаях малочисленнее и менее разнообразны, чем сообщества сахароразрушающих (ниже численность, меньше число видов, ниже индексы разнообразия). Среди углеводородокисляющих грибов грунтов литорали Белого и Баренцева морей наиболее обильными были Penicillium chrysogenum и P. brevicompactum, среди сахароразрушающих – Pseudogymnoascus pannorum, Acremonium fuci и P. chrysogenum. Сообщество углеводородокисляющих грибов в исследованных условиях можно рассматривать как обеднённое и немного перестроенное сообщество сахароразрушающих. Вместе с тем, присутствие в относительно чистых грунтах грибов, способных к утилизации углеводородов, свидетельствует о высоком адаптационном потенциале микобиоты литорали (учитывая, кстати, неспецифичность ферментов, участвующих в разложении различных углеводородов, в частности – лакказ и пероксидаз). Высокая адаптивность может быть важна на случай различных катастрофических событий, связанных с разливами большого количества нефти и нефтепродуктов. Важнейшими факторами, влияющими на структуру сообществ грибов загрязнённых и относительно чистых локаций побережья Белого и Баренцева морей, были доля углеводородов от общей массы органического углерода (доля УВ от Сорг) в случае углеводородокисляющих, и локация отбора образцов – в случае сахароразрушающих. Отметим также, что численность сообществ как углеводородокисляющих, так и сахароразрушающих грибов связана с солёностью (в обоих случаях выше при пониженной солёности) и заилением (чем сильнее заиление – тем численность грибных пропагул выше), но слабо связана с большинством параметров загрязнения, кроме доли УВ от Сорг. Мы можем констатировать, что в исследованных условиях содержание основных нефтяных фракций – алифатических (АУВ) и полициклических ароматических (ПАУ) углеводородов слабо влияют как на численность, так и на структуру сообществ грибов. Возможно, это связано с тем, что на исследованной территории относительно небольшие дозы загрязнения присутствуют как постоянный фон, слабо ингибирующие рост грибов, и не являющийся ценным пищевым ресурсом. Вторым значимым результатом является выявление культивируемого и молекулярного разнообразия лабиринтуломицетов в грунтах литорали Баренцева моря. Такие результаты были получены впервые для арктических морских экотопов. Из 25 образцов (по 5 образцов в каждой точке) были выделены 40 культур лабиринтуломицетов. Численность в целом небольшая, на порядок и меньше, чем грибов. Но, как и в случае с грибами, численность связана с заилением (чем выше заиление – тем больше культур лабиринтуломицетов выделяется) и солёностью (чем она ниже – тем выше численность). Кроме того, численность лабиринтуломицетов оказалась связана с долей Сорг (чем она выше – тем больше численность), и не связана с параметрами углеводородного загрязнения. Разнообразие культивируемых лабиринтуломицетов оказалось низким: два морфотипа были идентифицированы до уровня вида: Thraustochytrium aureum и Ulkenia visurgensis, оба – впервые в Баренцевом море, хотя известны для Белого; предполагается наличие трёх неописанных видов в роде Aurantiochytrium и 2 предполагаемых вида из неизвестного пока рода семейства Thraustochytriidae. Молекулярное разнообразие лабиритуломицетов значительно превышает разнообразие их культивируемых форм. В соответствии с последовательностями гена SSU, было выделено 25 OTUs (Операционных Таксономических Единиц), среди которых присутствовали многочисленные последовательности, соответствующие некультивируемым и неидентифицируемым представителям класса, а также последовательности, соответствующие нескольким видам траустохитрид и лабиринтулид. В частности, были обнаружены довольно многочисленные последовательности видов, выделенных нами в культуру – Ulkenia visurgensis и Thraustochytrium aureum. Ещё один результат связан с изучением влияния различных факторов среды на микобиоту грунтов сублиторали относительно незагрязнённого участка в Белом море. Оценка видового богатства с помощью кумулятивной кривой и расчёта ожидаемого полного числа видов с поправкой Chao2, показала, что видовое разнообразие выявлено примерно на 81%. Важно, что было использовано большое число образцов – 50, и даже оно не позволило выявить микобиоту полнее. Учитывая, что на структуру сообщества заметно влияет год отбора, такая картина выявления видового разнообразия вполне объяснима высокой изменчивостью состава микобиоты. Итак, ординация сообществ грибов методом nMDS с тестом ANOSIM показала высокую значимость объединения групп по признакам года отбора и типа грунта, а также года отбора и типа экотопа. Таким образом, важнейшим фактором для формирования микобиоты является тип грунта, связанный с типом берега и наличием пресного стока. Кроме того, сообщества мицелиальных грибов в исследованных донных грунтах меняются год от года. Если первичные сведения о составе микобиоты были получены стандартным методом посева, то последующий анализ и статистическая обработка крайне редко применяются в морской микологии. Кроме того, в ходе данной работы были выявлены преобладающие виды (Tolypocladium cylindrosporum, Penicillium chrysogenum, Tolypocladium inflatum, Penicillium glabrum и анаморфа Pseudogymnoascus pannorum), а также виды, новые для морей Арктики и Субарктики. Работы с образцами грунтов из различных районов Арктики – литорали Шпицбергена, Земли Франца-Иосифа, Новой Земли и острова Шокальского, а также удалённых от берега районов морей Баренцева, Восточно-Сибирского и Лаптевых, мы можем резюмировать следующим образом. Численность грибных пропагул как в грунтах литорали арктических островов, так и в донных грунтах арктических морей невелика, и составляет единицы-десятки колоние-образующих единиц на грамм. В грунтах литоралей, как по численности, так и по разнообразию, преобладают мицелиальные аскомицеты, базидиомицеты (в том числе дрожжи) редки, мукоровые грибы единичны. В донных грунтах высока доля дрожжей, в части образцов они являлись преобладающей группой. Разнообразие микобиоты при этом высоко, и в большинстве случаев велика доля редких и единичных морфотипов. Во всех исследованных грунтах очень широко распространены различные трудноидентифицируемые, и в частности, стерильные, изоляты. Их доля может составлять до половины всех выросших колоний. При этом молекулярная идентификация зачастую не позволяет соотнести их последовательности ДНК (область ITS) с последовательностями известных видов. Доля таких идентификаций составляет всего около 20%, а все остальные последовательности можно отнести только к категориям более высоким – родам, порядкам, классам и даже выше. Всё это, во-первых, в очередной раз свидетельствует о недостаточности сведений в базах, и, во-вторых – о высоком потенциале арктических морей как источников неописанного пока разнообразия грибов. Вместе с тем, можно довольно чётко выделить доминирующие группы, что особенно заметно в грунтах литоралей. Наиболее обильным и разнообразным здесь является класс Leotiomycetes. Обилие обусловлено, в первую очередь, видом Pseudogymnoascus pannorum, а разнообразие – многочисленными стерильными формами. Также существенный вклад в разнообразие могут вносить представители классов Dothideomycetes и Sordariomycetes, а Eurotiomycetes в большинстве случаев заметно им уступает. Ещё один интересный момент связан с имеющимися в литературе данными о распространении идентифицированных нами с помощью молекулярных методов видов или родов. Среди идентифицированных видов есть часть довольно обычных и широко распространённых, например, из родов Alternaria и Phoma. Но есть также и те, которые раньше были известны из Антарктиды и / или высокогорных районов, считались местными эндемиками, и сейчас впервые обнаружены в арктических морях (например, Psychrophila antarctica и Mortierella antarctica). Или обнаружены не впервые (Cadophora luteo-olivacea, виды рода Thelebolus), но наши находки подтверждают возможность биполярного эндемизма для этих грибов. В целом, микобиоту грунтов литорали арктических островов можно характеризовать как малочисленную, но разнообразную, с преобладанием мицелиальных аскомицетов, с высокой долей представителей класс Leotiomycetes, из которых самым обильным, как правило, является Pseudogymnoascus pannorum. Для донных грунтов также характерна низкая численность микобиоты (в большинстве случаев – ниже, чем в грунтах литорали), но также и меньшее её разнообразие; здесь могут преобладать дрожжевые грибы, и, в отличии от литоральных грунтов, выше значение представителей класса Eurotiomycetes из мицелиальных. 2) Исследование приспособленности выделенных культур к существованию в условиях арктических морей Для реализации этой задачи, различными способами, были проверены многочисленные культуры распространённых в арктических морях видов грибов. В целом можно констатировать, что практически все изученные культуры являются психротолерантами, с узкими оптимумами солёности в пределах от 10 до 35 промилль. Тем не менее, мы можем связать большую успешность в экспериментах с большей ролью в сообществах микобиоты. В частности, уже упоминавшийся чрезвычайно обильный в грунтах литоралей арктических морей вид P. pannorum, являлся также наиболее успешным и в ростовых экспериментах, и в тесте на прорастание спор, и в экспериментах в условиях экотопа. 3) Исследование способности выделенных культур к утилизации нефтяных углеводородов Все протестированные культуры были способны разлагать углеводороды, хотя и в различной степени. Отметим, что низкую способность к этому показали изоляты облигатных морских грибов, в частности Acremonium fuci и Asteromyces cruciatus. Наиболее высокая активность была показана Penicillium chrysogenum – вида, наиболее обильного в сообществах углеводородокисляющих грибов грунтов литорали Белого и Баренцева морей. 4) Исследование влияние нефтяного загрязнения на микробные сообщества в модельных экосистемах Впервые было проведено исследование влияния углеводородного загрязнения на микобиоту грунта литорали субарктического моря в условиях модельной экосистемы. Мы выяснили, что в данных условиях изменение численности колоние-образующих единиц грибов зависит от концентрации загрязнителя: чем выше загрязнение – тем ниже численность. Причём, при низких дозах загрязнения (1% дизельного топлива) изменения численности недостоверны. Кроме того, изменения в видовом составе грибов также связаны с изменение концентрации загрязнителя: чем выше загрязнение – тем ниже разнообразие. При высоких дозах загрязнения, увеличивается доля видов рода Penicillium, в частности – P. chrysogenum, и снижается доля малочисленных видов.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 26 февраля 2020 г.-26 декабря 2020 г. | Комплексное исследование бентосной микобиоты арктических морей и оценка её трансформации при нефтяном загрязнении |
Результаты этапа: Основным содержанием первого этапа выполнения проекта явились культуральные исследования разнообразия микобиоты грунтов различных районов Северного Ледовитого Океана: от северной части Баренцева моря и побережья Шпицбергена – до Восточно-Сибирского моря. Среди исследованных локаций были как островные территории (архипелаг Шпицберген, Земля Франца-Иосифа и Новая Земля – её западное и восточное побережья, остров Шокальского в Карском море), так и открытые воды северной части Баренцева моря и отдельных районов морей Лаптевых и Восточно-Сибирского. Для перечисленных районов подобные сведения мы получаем впервые. Мы показали, что в Северном Ледовитом океане, также как умеренных широтах, микобиота литорали богаче и разнообразнее микобиоты донных осадков: разница в численности составляет 1-2 порядка. Донные грунты, как правило, чрезвычайно бедны грибами, хотя в некоторых случаях мы наблюдали обильное развитие дрожжей. Кроме того, здесь преобладают стерильные формы. Стерильные изоляты грибов, как мы уже видели ранее – это важнейший ресурс разнообразия микобиоты в Северном Ледовитом Океане, так что при небольшой численности мы ожидаем высокого разнообразия микобиоты в донных осадках, новых интересных сведений о географии распространения различных таксономических групп грибов. Мы обнаружили преобладание аскомицетов из класса Leotiomycetes на всех островных территориях. В большинстве случаев обилие этой группы связано с массовым развитием анаморфы Pseudogymnoascus pannorum. Единственным пока исключением является микобиота литорали острова Шокальского: здесь грибное население, в целом малочисленнее, чем на других островах, хотя и не менее разнообразно. А наиболее обильными и разнообразными являются стерильные морфотипы, также относящиеся к Leotiomycetes. Объяснения причин этого интригующего факта у нас пока нет. Возможно, мы приблизимся к пониманию закономерностей формирования микобиоты Северного Ледовитого океана, когда будут получены финальные данные по другим его районам. Кроме культуральной работы по выявлению разнообразия, в этом году мы провели исследование особенностей роста выделенных культур в условиях повышенной солёности и пониженной температуры. Всего было протестировано 64 культуры грибов с литорали островов Шокальского и Новой Земли на трёх градациях температуры и четырёх – солёности. Эти довольно объёмные эксперименты показали, что большинство культур являются толерантными по обоим параметрам, а Pseudogymnoascus pannorum, действительно, лучше других приспособлен к пониженной температуре. Получены первые результаты скрининга углеводородразрушающих грибов, обитающих в прибрежной зоне чистых и загрязнённых нефтепродуктами локаций Баренцева и Белого морей. Обнаружено, что численность таких грибов не очень велика, а разнообразие – довольно высокое. Всего было выделено 35 изолятов дрожжей и 109 изолятов мицелиальных грибов. Наиболее частыми были виды Penicillium brevicompactum и Penicillium chrysogenum. | ||
2 | 1 января 2021 г.-28 декабря 2021 г. | Комплексное исследование бентосной микобиоты арктических морей и оценка её трансформации при нефтяном загрязнении |
Результаты этапа: 1) По запланированным пунктам: • К началу работ по молекулярной идентификации мицелиальных культур неясного таксономического положения, в нашей коллекции их было 263 изолята, выделенных из грунтов литорали Шпицбергена, Земли Франца-Иосифа, Новой Земли, и из донных грунтов морей Восточно-Сибирского и Лаптевых. Для 200 из них в 2021 году было полностью проведено молекулярно-генетическое исследование, для остальных это пока не сделано в силу различных, в основном технических, причин. Работы проводили в соответствии со следующей схемой: геномную ДНК выделяли с помощью коммерческих наборов LumiPure from AnySample (Lumiprobe, Германия) / FastDNA Spin Kit for Soil (MPBio) согласно приложенным протоколам. Далее, по стандартной схеме проводили ПЦР с использованием праймеров ITS1F и ITS4/ITS4R и очистку продуктов. Полученные в результате секвенирования хроматограммы обрабатывали в программе CodonCode Aligner. Последовательности анализировали с помощью BLAST (NCBI) по базе данных GenBank. Работы проводили частично в лаборатории экологии прибрежных донных сообществ Института океанологии им. П.П. Ширшова Российской академии наук, частично в лаборатории молекулярной биологии Биостанции им. Н.А. Перцова Биологического ф-та МГУ, частично на базе компании «Синтол». При дальнейшем изложении и обсуждении мы будем использовать понятие ОТЕ – Операционные Таксономические Единицы (OTUs – Operational Taxonomic Units) – некий аналог «вида» при молекулярных исследованиях разнообразия. Исходно это понятие использовалось при метагеномных работах, чтобы обозначить генетически отдельные единицы, которые не всегда соответствуют видам (в основном потому, что молекулярные базы данных ещё очень неполны), а могут выделяться на уровне рода или выше. Сейчас это понятие также нередко используется в тех случаях, когда проводится молекулярная идентификация выделенных культур, в силу тех же причин: частой невозможности найти соответствие на уровне вида, но при этом явная «отдельность» такой последовательности. В общей сложности у нас получилось 168 ОТЕ, и таким образом, большинству из них соответствовали единичные колонии. Но были некоторые, к которым относились несколько изолятов, и даже из разных точек отбора. Например, это были Mortierella antarctica с литорали Новой Земли и Земли Франца-Иосифа, Cadophora luteo-olivacea с литорали Новой Земли и Шпицбергена и из донного грунта моря Лаптевых, Thelebolus globosus также с литорали Новой Земли и Шпицбергена. По несколько колоний соответствовали ОТЕ в родах Alternaria, Thelebolus, Phoma, Cadophora, Cladosporium. Отметим, что только 38 ОТЕ могут быть отнесены к каким-то видам. В большинстве случаев полученные ОТЕ соответствуют категориям от рода и выше, в некоторых случаях – на уровне классов / отделов, или даже всего царства Грибов. Больше всего последовательностей относится к отделу Ascomycota, 15 – к отделу Basidiomycota, и всего 2 – к отделу Mucoromycota; 2 OTUs имеют неясное положение среди царства Fungi. Среди аскомицетов преобладающими были классы Dothideomycetes, Leotiomycetes и Sordariomycetes. Таким образом, применение молекулярных методов значительно расширило сведения о разнообразии грибов в исследованных экотопах. Предварительные морфолого-культуральные исследования разнообразия дали в общей сложности для всех этих образцов около 40 видов. Хотя, по численности колоний они и преобладают в большинстве образцов, разнообразие их относительно невысоко. Здесь были отмечены в основном Pseudogymnoascus pannorum, виды рода Penicillium и Tolypocladium. Ещё один интересный момент связан с имеющимися в литературе данными о распространении идентифицированных нами с помощью молекулярных методов видов или родов. Среди идентифицированных видов есть часть довольно обычных и широко распространённых, например, из родов Alternaria и Phoma. Но есть также и те, которые раньше были известны из Антарктиды и / или высокогорных районов, считались местными эндемиками, и сейчас впервые обнаружены в арктических морях (например, Psychrophila antarctica и Mortierella antarctica). Или обнаружены не впервые (Cadophora luteo-olivacea, виды рода Thelebolus), но наши находки подтверждают возможность биполярного эндемизма для этих грибов. Распределение идентифицированных изолятов по образцам и точкам отбора ещё будет детально проанализировано. Предварительно можем отметить, что среди культур неясного таксономического положения (в основном стерильных), выделенных из грунтов литорали Новой Земли и Земли Франца-Иосифа, преобладают представители класса Dothideomycetes, а из грунтов литорали Шпицбергена и из донных грунтов морей Восточно-Сибирского и Лаптевых – класса Leotiomycetes. Класс Sodrariomycetes и отдел Basidiomycota представлены везде более-менее равномерно, и нигде не являются лидирующим. Находки представителей Mucoromycota единичны. В целом все полученные данные оригинальны, новы и уникальны, в первую очередь, в связи с уникальностью исследуемых экосистем. • Из загрязнённых нефтепродуктами и чистых локаций побережий Белого и Баренцева морей в ходе реализации данного проекта, в 2020 году мы выделили 629 колоний мицелиальных грибов. В 2021 году мы закончили их морфолого-культуральную идентификацию и сортировку, и выявили 52 культуры неясного таксономического положения, с которыми провели молекулярно-генетический анализ описанным выше способом. В общей сложности мы выделили 34 ОТЕ, и, таким образом, части из них соответствовали по 2 и более колоний. На уровне вида удалось найти соответствие для 16 ОТЕ, для остальных – только на уровне рода и выше, вплоть до отдела Ascomycota. В целом, среди исследованных культур были обнаружены только представители отдела Ascomycota. Наиболее представленным классом был Sordariomycetes, далее – Dothideomycetes, а Leotiomycetes им уступал. Данные, полученные по этим чистым и загрязнённм нефтепродуктами локациям литорали Белого и Баренцева морей, ещё будут детально проанализированы. Но уже сейчас мы можем обратить внимание на две особенности, отличающие их от литоралей исследованных ранее арктических островов (Шокальского, Новой Земли, Земли Франца-Иосифа, Шпицбергена): 1. Относительно меньшее число стерильных изолятов; 2. Преобладание среди культур неясного положения представителей классов Sordariomycetes, а не Dothideomycetes и Leotiomycetes. Предварительно мы предполагаем, что это может быть связано с относительно более мягкими условиями на побережье Белого и Баренцева морей, по сравнению с удалёнными от материка арктическими островами. Принципиальной разницы в составе идентифицированных в результате этих работ культур между чистыми и загрязнёнными углеводородами локациями мы не обнаружили. В целом, эта разница заключается в основном в общей численности и структуре микобиоты, что было показано ещё при первичном анализе в 2020 году. Результаты 2021 года в первую очередь расширяют сведения о составе микобиоты. • В июне 2021 года мы провели первую проверку выживаемости спор грибов при замораживании, а в декабре 2021 – вторую. Эксперимент был заложен в конце 2020 года, и мы разработали и применяем следующую схему: с культуры, выращенной на агаризованной среде сусло-агар (0,5% общего сахара, солёность 25 промилль, 10 суток роста) на чашке Петри, делали смыв природной стерильной морской водой солёностью 25 промилль, доводили до концентрации 100 спор в 1 мл (расчет исходной концентрации в камере Горяева), добавляли 0,1% Twin80 для предотвращения слипания. Для каждой культуры делали по 10 повторностей по 1 мл в двух-миллилитровые криопробирки и помещали их в морозильную камеру на -20°С. Проверка жизнеспособности проводится с помощью посевов: по 0,2 мл на чашку, всего по 5 чашек и по 2 пробирки для каждого изолята гриба в один срок. Инкубация чашек с посевами проводится при +6°С в течение 14 суток. Таким образом, мы используем всю суспензию, находящуюся в пробирке в каждом случае. Первый посев мы сделали перед заморозкой. Второй – как и было указано, в июне 2021 года, третий – в декабре 2021. Всего мы использовали 20 культур 7 видов грибов: Pseudogymnoascus pannorum (6 культур), Tolypocladium cylindrosporum (2), Tolypocladium inflatum (2), Cladosporium sphaerospermum (2), Paradendryphiella salina (3), Acremonium fuci (3), Penicillium chrysogenum (2). Выбор данных видов был связан с их широкой распространённостью в арктических морях. Были взяты культуры, выделенные ранее из грунтов литорали Белого и Баренцева морей. По результатам первого посева, сделанного перед заморозкой, доля прорастающих спор составила 92-98%. Достоверной разницы между разными видами или изолятами одних видов, выделенных из разных морей, не было обнаружено. Первая проверка, проведённая через 6 месяцев заморозки, показала общее снижение числа прорастающих спор в среднем на 4%. Здесь мы опять не обнаружили достоверной разницы ни между разными видами, ни между изолятами одних видов. Третья проверка показала, что для всех изолятов Pseudogymnoascus pannorum доля прорастающих спор снизилась на 2-5%. А для остальных анализируемых видов – на 7-11%, и между ними достоверной разницы не обнаружено. Таким образом, в течение 1 года заморозки суспензии спор в морской воде, мы наблюдаем постепенное снижение потенциала прорастания, в меньшей степени выраженное у изолятов Pseudogymnoascus pannorum, чем у изолятов других видов. Вместе с тем, снижение этого потенциала в целом довольно слабое, не превышающее 13% от исходного. Соответственно, предварительный вывод из этих экспериментов такой: замораживание в морской воде приводит к постепенному снижению способности грибных спор к прорастанию, но не лишает их такой способности полностью, по крайней мере, в течение года. Эксперимент будет продолжен, по крайней мере, ещё на полгода (до июня 2022 года). • Запланированные эксперименты по оценке влияния нефтяного загрязнения на бентосную микобиоту в условиях модельных экосистем мы проводили в рамках полевых работ по проекту (см. отчёт о полевых / экспедиционных работах). • Исследование прорастания спор грибов в также было проведено в рамках полевых работ по проекту (см. отчёт о полевых / экспедиционных работах). • Весной 2021 мы провели запланированные эксперименты по утилизации углеводородов культурами мицелиальных грибов. Для этого отобрали 11 чистых культур из числа тех, что показали способность к росту на среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода при выделении из исходного грунта литорали Белого и Баренцева морей (посевы 2020 года). Биомассу чистой культуры в трех повторностях помещали в колбы со 100 мл жидкой модифицированной среды Чапека (1% о/о дизельного топлива зимнего, 0.2% в/о NaNO3, 0.1% в/о KH2PO4,0.05% в/о MgSO4*7H2O, 0.05% в/о KCl, 2% в/о морской соли, 0.1% о/о Tween 80). Затем колбы помещали на орбитальный шейкер на 130 оборотов в минуту при температуре 8°С. В Контроль биомассу не добавляли. Экстракцию углеводородов проводили согласно широко применяемому методу экстракции гексаном (ГОСТ Р ИСО 11338-2-2008). Для этого в каждую пробу спустя 5 недель после начала опыта добавляли 20% о/о н-гексана эталонного. После этого пробы перемешивались на орбитальном шейкере при 220 оборотах в минуту при температуре 25°С в течение 30 минут. После этого эмульсию отстаивали в течение 10 минут для разделения водной и органической фазы. Затем неполярную фазу вытесняли в горловую часть колбы дистиллированной водой, аккуратно вносимой по стенке сосуда. Органическую фазу отбирали из горловой части сосуда с помощью стеклянной пипетки и переносили ее в стеклянный бюкс. Для избавления от лишней влаги 1 мл хорошо перемешанной органической фазы помещали на воронку с заранее прокаленным Na2SO4 и промывали прогретым до 40°С 10 мл н-гексаном эталонным объемом при помощи стеклянного шприца. Элюат собирали в предварительно взвешенные и промаркированные стеклянные бюксы объемом не менее 10 мл. Отобранный в бюксы элюат оставляли сушиться под тягой в течение одних суток. После высыхания элюата бюксы взвешивали на аналитических весах. Массу остаточных углеводородов рассчитывали по формуле: mбюкса после высыхания – mбюкса. Процент биотического вклада в убыль углеводородов рассчитывали по формуле: (mостаточных углеводородов в контроле – mостаточных углеводородов в образце) / mостаточных углеводородов в контроле * 100%. По результатам гравиметрии было показано, что из всех протестированных видов наиболее высокую убыль остаточных углеводородов показали Penicillium chrysogenum, Cadophora fastigiata и Tolypocladium inflatum, разрушив, в среднем, 77.4%, 72% и 67.23% углеводородов соответственно. Об углеводородразрушающей способности грибов уже было ранее известно. Но об такой способности морских грибов очень мало данных. А углеодородразрушающий потенциал грибов в арктических морских условиях был исследован нами впервые. Мы обнаружили, что при пониженной температуре и повышенной солёности грибы могут разрушать УВ, причём довольно эффективно. Заметим, что наибольшую эффективность показали виды рода Penicillium, которые были наиболее распространены в самых загрязнённых локациях побережья Белого и Баренцева морей в исследованиях 2020 года. Данное исследование в целом закончено, и мы планируем включить его в материалы, которые готовим для публикации по разнообразию и приспособленности УВ-разрушающей микобиоты литорали арктических морей. Вместе с тем, мы начали исследование УВ-разрушающей активности мицелиальных грибов арктических морей, и подобных работ ранее никто не проводил и не публиковал. В то же время, проблема загрязнения Северного Ледовитого Океана нефтепродуктами существует, и такое исследование весьма интересно и перспективно. Поэтому мы планируем продолжить поисковые работы, включив в них также дрожжевые формы и траустохитриевых протистов, а также расширив географию. Более подробно это будет описано в планах на 2022 год. • Летом 2021 года были получены первичные результаты по содержанию и структуре биомассы в образцах морей Лаптевых и Восточно-Сибирского, а также Северо-Баренцевоморского кластера. Определение структуры грибной биомассы проводили обычным в таких случаях методом люминисцентной микроскопии. Численность грибных структур регистрировали по свечению в препаратах калькофлуора белого, связанного с хитином клеточных стенок грибов. Просматривали по 20 полей зрения на стекле. В настоящее время у нас есть только первичные сведения о численности спор и длине гиф в препаратах. В ближайшее время мы планируем пересчитать их на исходный объём и перевести в биомассу. Пока можно только сказать, что биомасса представлена в основном спорами, грибных гиф исчезающе мало, и примерно в половине образцов они вообще не были обнаружены. Это вполне объяснимо в связи с особой экстремальностью исследованных грунтов. Подобные сведения на столь обширном географическом материале поручены впервые. Предыдущие – по центральной части Баренцева моря и по литорали одного из островов Карского моря были также получены ранее нами. Данные результаты после пересчётов будут включены в общую массу сведений о донных грунтах перечисленных морей, дополнив сведения о культивируемой части микобиоты. • Попытка выделения грибов из образцов морей Лаптевых и Восточно-Сибирского, а также Северо-Баренцевоморского кластера в анаэростатах не удалась. Мы не выделили ни одной колонии грибов. Параллельно с выделением в анаэростатах, мы проводили выделение обычным методом. В этом случае численность выделившихся колоний была очень низкой, и из большинства образцов не выделилось ничего. Мы предполагаем, что всё это связано с долгим хранением образцов, так как в трёх последовательных посевах из них мы наблюдали постепенное снижение численности выделяемых грибов. В таком случае мы считаем все работы с этими образцами оконченными. У нас имеются сведения о составе культивируемой части микобиоты и о биомассе грибов. Все они вместе свидетельствуют о крайне низком содержании грибов в донных грунтах морей Северного Ледовитого океана, особенно в удалённых от побережий районах. 2) В дополнение к запланированному на 2021 • Из образцов литоральных грунтов Белого и Баренцева морей мы провели выделение общей ДНК для последующего метагеномного исследования разнообразия грибов и траустохитрид. ДНК была выделена из 30 образцов грунтов литорали, собранных в 2020 году на побережье Баренцева (по 2 образца из 5 точек, всего 10 образцов) и Белого (по 2 образца из 10 точек, всего 20 образцов) морей, тех же самых, с которыми проводили культуральные исследования. Выделяли с помощью набора Quick-DNATM Fecal / Soil Microbe MiniPrep Kit (Zymo Research) согласно приложенным протоколам на базе отдела биологии и химии почв ФГБУ ФИЦ «Почвенный институт им. В.В. Докучаева», самостоятельно, с помощью коллег. Это пока промежуточный этап пионерной работы по исследованию разнообразия микобиоты побережья Баренцева и Белого морей двумя методами – классическими культуральными и молекулярно-генетическими, реализуемой в рамках настоящего проекта. • Из образцов литоральных грунтов Баренцева моря было проведено выделение траустохитрид. Образцы всё те же, отобранные летом 2020 года, из которых уже были выделены мицелиальные грибы и тотальная ДНК, хранились в холодильнике. Для выделения использовали следующую схему: в пробирки со стерильной морской водой добавляли небольшое количество исследуемого грунта и пыльцу сосны в качестве приманки. На каждый образец использовали 12 повторов пробирок. Далее, через две недели микроскопировали приманки, и при обнаружении заражённых приманок пересаживали их штрихом в чашки Петри на агаризованную среду BY+ (глюкоза – 5 г/л, пептон – 1 г / л, дрожжевой экстракт – 1 г / л, морская вода солёностью 25 ‰) с добавлением антибиотика цефтриаксона (300 мг / л) и противогрибного препарата амфотерицина (1,5 мг / л). Если заражения не обнаруживали, то микрокопировали ещё через 1 неделю и ещё через 1 неделю. Если по прошествии 4 недель заражения приманки не обнаруживали, то считали, что траустохитриды не выделились. Подобный метод описан и литературе и широко применяется, но мы немного его адаптировали под наши нужны, в частности это касалось сроков экспозиции и состава смеси противомикробных препаратов. Всего мы выделили 40 культур траустохитрид, из 4 точек (из грунта точки BS4 ничего не выделилось). Траустохитриды выделились из 11 образцов, а из 14 – не выделились. В целом, удачность выделения была довольно низкой, что может быть связано с действительно низкой численностью траустохитрид в исследованных грунтах, но также и с длительным хранением (более 6 месяцев) образцов. Первично мы провели анализ внешних признаков выделившися культур, обнаружили, что выделились культуры нескольких морфотипов. Но идентификацию культур мы планируем проводить исключительно молекулярными методами, в связи с тем, что это является обычной мировой практикой. Кроме того, не существует современных определителей, основанных на анализе морфологических признаков для этой группы. Поэтому из всех полученных колоний мы выделили ДНК. Выделение осуществляли по стандартной схеме, с использованием набора FastDNA Spin Kit for Soil (MPBio) согласно приложенному протоколу и пары праймеров LABY-A / LABY-Y (целевой участок 18S рДНК). Т.к. целевая ДНК выделилась на указанных праймерах, специфичных к лабиринтулам, и в частности – к траустохитридам, мы можем уверенно сказать, что все полученные культуры относятся именно к этой группе. Все результаты по этой части работ носят предварительный характер, предстоит ещё закончить молекулярные работы и идентифицировать культуры, провести анализ результатов. Тем не менее, можем отметить, что впервые из грунтов литорали Баренцева моря выделены культуры сапротрофных лабиринтул (траустохитрид), обнаружено присутствие нескольких их морфотипов. Коллекция культур поддерживается, выделены фрагменты ДНК для дальнейшего секвенирования, что всё вместе является основой для продолжения данной работы и получения новейших данных о распространении данной группы грибоподобных организмов в морях Северного Ледовитого океана. | ||
3 | 1 января 2022 г.-26 декабря 2022 г. | Комплексное исследование бентосной микобиоты арктических морей и оценка её трансформации при нефтяном загрязнении |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".