|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Молекулярные основы морфологического разнообразия архитектуры колоний текатных гидроидных полиповНИР
Molecular basis of morphological diversity of the colony architecture of thecate hydroid polyps
- Руководитель НИР: Кремнёв С.В.
- Участники НИР: Багаева Т.С., Ветрова А.А., Евстифеева А.Ю., Коноров Е.А., Купаева Д.М.
- Подразделение: Кафедра эмбриологии
- Срок исполнения: 1 января 2020 г. - 31 декабря 2022 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 20-04-00978а
- Номер ЦИТИС: АААА-А20-120011690168-3
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физиологические механизмы деятельности, развития и устойчивости организма человека и животных
- ПН России: Науки о жизни
- Критическая технология России: Геномные, протеомные и постгеномные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.03.17 Эволюционное учение
- 34.33.15 Зоология беспозвоночных
- Классификатор OECD: Эволюционная биология
-
Ключевые слова:
dynamena pumila, gonothyraea loveni., план строения, колониальность, эволюционная биология развития, hydrozoa, морфогенез, cnidaria, сигнальные каскады
evolutionary developmental biology, dynamena pumila, morphogenesis, coloniality, hydrozoa, body plan, cell signaling, cnidaria, gonothyraea loveni -
Описание:
Колониальные организмы, принадлежащие к филогенетически далеким друг от друга таксонам, составляют значительную часть биоразнообразия нашей планеты. Отличительной особенностью колониальных животных является непрерывный рост и морфогенез на протяжении всей жизни колонии, что делает их ценными модельными объектами для изучения морфогенетических и молекулярных механизмов разметки плана строения. Однако в настоящее время большинство исследований в области Evo-Devo сосредоточено на изучении неколониальных организмов, а механизмы развития и эволюции колонии остаются без внимания. Примером филогенетической группы, для которой колония является доминирующей жизненной формой, является класс Hydrozoa (Cnidaria). Морфологическое разнообразие гидроидных полипов основано именно на разнообразии архитектуры их колоний. Какие молекулярные механизмы обеспечивают устойчивое формирование сложной структуры колоний? "Научились" ли колониальные гидроиды в ходе эволюции использовать консервативные сигнальные пути, которые обеспечивают разметку тела одиночных полипов? Ответы на эти вопросы позволят приблизиться к решению фундаментальной проблемы эволюционной биологии развития - формирования разнообразия планов строения животных. В качестве модельных объектов для нашей работы мы выбрали морских колониальных гидроидов с разными типами организации колонии: Dynamena pumila (моноподиальный рост и ветвление) и Gonothyraea loveni (симподиальный рост и ветвление). Архитектуру колонии текатных гидроидов определяет морфогенетическая активность верхушек роста побегов. В ходе выполнения проекта будет проведено полномасштабное сравнительное исследование молекулярной разметки верхушек роста колоний модельных видов, а также будет выявлена роль отдельных сигнальных каскадов и их компонентов в регуляции определения морфологии колоний. С помощью метода RNA-seq мы количественно и качественно исследуем репертуар экспрессии генов компонентов сигнальных каскадов (в первую очередь Wnt, BMP и Nodal), предположительно вовлечённых в разметку верхушек роста колоний. Пространственно-временные особенности экспрессии генов интереса будут исследованы методом гибридизации in situ. Также с помощью фармакологических методов будет выявлена функциональная роль сигнальных каскадов и отдельных их компонентов в формировании разных типов архитектуры колонии гидроидных полипов. К колониальным гидроидам будет впервые применен метод нокдауна экспрессии генов при помощи антисмысловых олигонуклеотидов vivo-morpholino. С помощью этого метода будет исследована роль отдельных компонентов исследуемых сигнальных каскадов. При анализе всех полученных данных будут выявлены молекулярные механизмы, лежащие в основе архитектурного разнообразия колоний текатных гидроидных полипов. Наши результаты внесут вклад в понимание эволюции способов использования консервативного инструментария регуляторных генов Metazoa, обеспечивающих разнообразие планов строения животных. Наши исследования, вероятно, позволят выяснить, являются ли консервативные сигнальные каскады предковыми регуляторами морфогенеза ветвления эпителиальных трубок (branching morphogenesis), который сопровождает как формирование колоний гидроидных полипов, так и развитие некоторых органов позвоночных (напр. легких, почек и молочных желез).
-
Abstract:
Colonial organisms, which belong to phylogenetically distant taxa, constitute a significant component of the biodiversity of our planet. A distinctive feature of colonial animals is the continuous growth and morphogenesis throughout the life of the colony, which makes them valuable model organisms for studying the morphogenetic and molecular mechanisms of body-plan patterning. However, the majority of the Evo-Devo research is focused on the study of non-colonial organisms while the mechanisms of development and evolution of the colony are ignored. An example of a phylogenetic group in which a coloniality is the dominant life form is the class, Hydrozoa (Cnidaria). The morphological diversity of hydroid polyps is based on the diversity of colony architectures. One question that arises is which molecular mechanisms regulate the robust formation of the complex colony structure? Another is if colonial hydroids "learn" to use conservative signalling pathways during evolution which pattern the bodies of solitary polyps? Answers to these questions will bring us closer to solving the fundamental problem of evolutionary developmental biology - the formation of a variety of animal body plans. As model organisms for our work, we chose marine colonial hydroids with different types of colony organization: Dynamena pumila (monopodial growth and branching) and Gonothyraea loveni (sympodial growth and branching). The colony architecture of thecate hydroids is determined by the morphogenetic activity of the shoot-growth tips. During our project, we will conduct multi-scale comparative investigation of molecular patterning of the shoot-growth tips of our model hydroids. Additionally, we will reveal role of the certain signalling cascades and their constituents in regulation of colony architecture development. Applying the RNA-seq method, we quantitatively and qualitatively examine the repertoire of gene expression of components of signalling cascades (primarily Wnt, BMP, and Nodal), which are supposedly involved in colony growth-tip patterning. Spatio-temporal expression patterns of the genes of interest will be assessed with in situ hybridization. Moreover, with the aid of pharmacological methods, the functional role of signalling cascades and their individual elements in the formation of various types of colony architectures of hydroid polyps will be uncovered. For the first time, will be employing vivo-morpholino antisense oligonucleotides for gene expression knockdown in colonial hydroids. With this method, we will analyse the role of certain features of the studied signalling pathways. An evaluation of all the data obtained will then establish the molecular mechanisms that underlie the architectural diversity of thecate hydroid colonies. Our results will contribute to understanding the evolution of ways to use the conservative toolset of Metazoa regulatory genes that guide a variety of animal body plans. Moreover, our studies will determine whether conservative signalling cascades are ancestral regulators of branching morphogenesis, which accompanies both the formation of colonies of hydroid polyps and development of certain vertebral organs (e.g., lungs, kidneys, mammary glands).
-
Планируемые результаты:
Исходя из поставленной цели нашего проекта, на основе проведенных исследований мы получим многоплановую картину использования консервативного инструментария регуляторных генов Metazoa при формировании морфологического разнообразия архитектуры колоний гидроидных полипов. Наиболее подробно будет исследована роль канонического Wnt, BMP и Nodal сигнальных каскадов. К окончанию проекта будут опубликованы 3 статьи в международных реферируемых журналах из категории Q1-Q2. Промежуточные результаты проекта будут соответствовать поставленным задачам. 1) Будут идентифицированы ортологи компонентов сигнальных каскадов Wnt, BMP и Nodal у колониальных гидроидных полипов D. pumila и G. loveni. 2) Методами RNA-seq и последующего биоинформатического анализа полученных данных будет охарактеризован качественный и количественный репертуар генов компонентов сигнальных каскадов Wnt, BMP и Nodal экспрессирующихся в областях активного роста и морфогенеза колоний D. pumila и G. loveni. 3) Методом гибридизации in situ будут исследованы особенности паттернов экспрессии компонентов сигнальных каскадов Wnt, BMP и Nodal в областях активного роста и морфогенеза колоний D. pumila и G. loveni. 4) Будет исследована функциональная роль сигнальных каскадов Wnt, BMP и Nodal и отдельных их компонентов в формировании архитектуры и морфологии колоний D. pumila и G. loveni фармакологическими методами. 5) Будет отработан и применён метод нокдауна экспрессии генов при помощи антисмысловых олигонуклеотидов vivo-morpholino на колониальных гидроидных полипах. С его помощью будет исследована функциональная роль конкретных компонентов сигнальных каскадов в молекулярной разметке верхушек роста побега D. pumila и G. loveni. При анализе всех полученных данных будут выявлены базовые молекулярные механизмы, лежащие в основе архитектурного разнообразия колоний текатных гидроидных полипов. Наши результаты внесут вклад в понимание способов использования консервативного инструментария регуляторных генов Metazoa, обеспечивающих разнообразие планов строения тела животных в ходе эволюции. Более того, наши данные позволят предположить, является ли механизм регуляции морфогенеза ветвления эпителиальных трубок (branching morphogenesis) предковым или конвергентным. Таким образом, открываются большие перспективы для изучения эволюции молекулярных механизмов регуляции морфогенеза ветвления эпителиальных трубок, который сопровождает формирование колоний гидроидных полипов и развитие некоторых органов позвоночных (напр. легких, почек и молочных желез).
-
Научный задел:
В нашу исследовательскую группу входят научные сотрудники и выпускники с разных кафедр биологического факультета МГУ им. Ломоносова: с.н.с Кремнёв С.В. – кафедра эмбриологии; н.с. Евстифеева А.Ю. – кафедра эмбриологии; с.н.с Коноров Е.А. – Институт Общей Генетики им. Вавилова, выпускник кафедры биологической эволюции; аспирант Багаева Т.С. - выпускник кафедры эмбриологии; аспирант Купаева Д.М. – выпускник кафедры зоологии беспозвоночных; аспирант Ветрова А.А - выпускник кафедры эмбриологии. Такой междисциплинарный состав позволит наиболее эффективно провести работы по заявляемому проекту и проанализировать полученные результаты. Исследования и квалификация членов группы находятся в области заявляемого проекта. Кремнёвым С.В. была выявлена диверсификация молекулярной разметки нервной трубки у позвоночных (Kremnyov et al., 2018) и выяснены механизмы определения право-левой асимметрии тела личинок иглокожих (Tisler et al., 2016). Багаевой Т.С., Купаевой Д.М. Ветровой А.А. и Кремнёвым С.В. были выявлены молекулярные сигнальные пути участвующие в определении типа колонии текатных гидроидных полипов (Bagaeva et al.,2019). Купаева Д.М. Ветрова А.А. и Кремнёв С.В. описали клеточные механизмы морфогенеза отдельных частей колоний гидроидных полипов (Kupaeva et al., 2018). Купаевой Д.М. Коноровым Е.А. и Кремнёвым С.В. был собран de novo и проанализирован референсный транскриптом D. pumila (Kupaeva et al., 2019). Коноров Е.А активно участвует в работах по сборке и анализу геномов различных организмов (Konorov et al., 2017; Logacheva et al., 2017). Евстифеевой А.Ю. и Кренёвым С.В. описана клеточная динамика в эмбриональных эпителиях Xenopus в ответ на изменение механического натяжения (Евстифеева и др. 2010).
- Добавил в систему: Кремнёв Станислав Валерьевич
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. | Молекулярные основы морфологического разнообразия архитектуры колоний текатных гидроидных полипов |
| Результаты этапа: В ходе выполнения проекта мы собрали материал для исследования молекулярной разметки тела колониальных текатных гидроидных полипов Dynamena pumila и Gonothyraea loveni. Процесс пробоподготовки и работа с этими объектами имеют значительные различия по сравнению со всеми другими модельными организмами, поэтому все запланированные методики были адаптированы и оптимизированы нами непосредственно для наших объектов исследования. Нами были собраны и проанализированы транскриптомы из разных частей колонии D. pumila и G. loveni. В ходе анализа нам удалось определить оптимальные референсные гены для дальнейших исследований с применением метода ПЦР в реальном времени. Далее нами был проведён массовый автоматический анализ дифференциальной экспрессии генов в верхушках роста и зрелых гидрантах D. pumila. Особое внимание мы обратили на два гена, гомеобоксный транскрипционный фактор Dlx и атипичный кадгерин FAT4, уровни экспрессии которых в гидранте и верхушке роста ярко различаются. Полученные результаты по генам Dlx и Fat4 были подтверждены методом ПЦР в реальном времени. Таким образом, с применением транскриптомного подхода, нами были выявлены два гена, наиболее вероятно связанные с функционированием и разметкой верхушки роста у D. pumila. Компонентом Wnt каскада, который может участвовать в спецификации верхушки роста побега D. pumila по транскриптомным данным может являться Wnt8. Для проведения гибридизации in situ мы клонировали участки генов всех идентифицированных лигандов сигнального пути Wnt у D. pumila и G. loveni. Также, для обоих видов гидроидов мы клонировали компоненты регуляторного комплекса Wnt, ко-транскрипционные факторы, ко-рецептор LRP и рецепторы Frizzled, а также эндогенные ингибиторы Wnt каскада. Таким образом, мы получили предварительную картину молекулярной разметки верхушки роста побега D. pumila и приступили к выяснению молекулярной разметки верхушки роста побега G. loveni. Кроме того, начаты исследования молекулярной разметки тела личинок исследуемых гидроидов. Были проведены исследования роли активности канонического сигнального пути Wnt и его компонентов в становлении плана организации колонии и личинок D. pumila и G. loveni. Мы выяснили, что ингибирование активности Wnt каскада у G. loveni приводит к подавлению дифференцировки гидранта и сохранению постоянно функционирующей верхушки роста побега на конце первичного полипа. Также, в экспериментах по модуляции активности Notum, эндогенного ингибитора канонического Wnt каскада, мы выяснили, что повышение уровня активности сигнального пути Wnt вызывает трансформацию верхушки побега в верхушку роста столона. Таким образом, мы показали, что для дифференцировки разных частей колонии G. loveni необходим разный уровень активности канонического Wnt каскада. Кроме того, мы показали, что у гидроидов Notum не участвует в становлении оси тела на стадии планулы. Однако ингибирование Notum, вероятно, приводит к локальному увеличению уровня активности Wnt и индукции формирования у личинки гидроидов «рта», которого в норме ни у одного представителя этого класса книдарий на данной стадии жизненного цикла не наблюдается. К сожалению, мы пока не знаем, какой полип в конечном итоге формируется из такой гидроидной планулы «со ртом» и проходит ли такая личинка метаморфоз. В следующем сезоне планируется продолжить эти исследования. Нами начаты исследования по подавлению активности отдельных генов во взрослых колониях гидроидов с помощью морфолино олигонуклеотидов, а также начата отработка метода по нокдауну генов с помощью shRNA. В настоящий момент подготовлена к публикации статья с данными, полученными в ходе выполнения данного проекта. Статья направлена в редакцию журнала Developmental Dynamics. Таким образом, большая часть запланированных работ была выполнена. | ||
| 2 | 1 января 2021 г.-28 декабря 2021 г. | Молекулярные основы морфологического разнообразия архитектуры колоний текатных гидроидных полипов |
| Результаты этапа: Во второй год проекта мы продолжили наши исследования по транскриптомному анализу молекулярной разметки плана строения гидроидных полипов с разной архитектурой колоний. Как и было запланировано мы секвенировали транскриптомы верхушек роста побега первичных колоний D.pumila после активации канонического Wnt (cWnt) каскада. Также были собраны и секвенироаваны образцы тотальной РНК верхушек роста побега и столона G. loveni. В ходе анализа полученных транскриптомов мы оценили дифференциальный уровень экспрессии отдельных генов-интереса, большинство из которых участвует в регуляции активности Wnt каскада. Также, методом гибридизации in situ были исследованы пространственные паттерны экспрессии генов компонентов Wnt каскада. Основываясь на полученных нами данных, мы предполагаем, что у колониальных гидроидов Wnt3 и Wnt8, вероятно, отвечают за индукцию формирования верхушки роста побега, Wnt7 отвечает за область спецификации гидрантов, а Wnt2 участвует в установлении границы ценосарка и гидранта. При использовании метода автоматической аннотации дифференциально экспрессирующихся генов в интактных верхушках роста D. pumila и верхушках роста после активации cWnt мы обратили особое внимание на два гена, экспрессия которых меняется в два и более раз: BMP2 (лиганд BMP сигнального каскада) и LGR4 (рецептор, сопряжённый с G-белком, связывающий R-spondin, который активирует cWnt). Мы предполагаем, что выявленные гены, вероятно, участвуют в молекулярной разметке верхушки роста у D. pumila. Как и было запланировано, мы исследовали пространственный паттерн экспрессии генов FAT4 и Dlx в колониях гидроидных полипов с помощью гибридизации in situ, а также приступили к исследованиям роли этих генов в регуляции роста колоний с помощью shRNA. Была показана вероятная роль FAT4 в формировании осевого организатора гидранта и в регуляции морфогенетических процессов в ходе метаморфоза. Основываясь на анализе пространственного паттерна экспрессии гена Dlx в колониях D. pumila и G. loveni мы предположили, что Dlx у гидроидов участвует в процессе определения границ между ценосарком и остальными частями колонии. Для проверки данной гипотезы и исследования эволюционной консервативности функций гена Dlx в регуляции установления границ между зачатками в ходе развития животных, мы экспрессировали ген Dlx D.pumila в эмбрионах шпорцевой лягушки. Анализ полученных данных позволяет утверждать, что универсальной и консервативной функцией гомеобоксного гена Dlx появившегося еще до возникновения билатерально-симметричных животных, скорее всего, является установление границ между зачатками развивающихся организмов, но не формирование выростов стенок тела, как предполагают некоторые авторы. Были проведены исследования роли активности Nodal сигнального пути в становлении плана организации колонии D. pumila и G. loveni. Мы выяснили, что ингибирование Nodal каскада у D. pumila приводит формированию дополнительной септы перисарка в ходе морфогенеза верхушки роста побега первичной колонии. Это, в свою очередь, приводит к разделению верхушки роста побега не на три зачатка, как происходит в норме, а на четыре. Ингибирование Nodal каскада в ходе формирования первичных колоний G. loveni полностью останавливало рост верхушки роста побега. Интересно отметить, что фармакологическое ингибирование Nodal не нарушало процесс формирования новых верхушек роста побегов в ходе регенерации взрослых колоний G.loveni. Таким образом, можно предположить, что Nodal сигнальный каскад имеет ключевое значение при формировании верхушки роста побега во время метаморфоза и формирования первичной колонии гидроидов, но не играет существенной роли при регенерации. Нами начаты исследования по подавлению активности гена Notum, эндогенного ингибитора Wnt, в развитии D. pumila с помощью shRNA. В настоящий момент опубликована статья с данными, полученными в ходе выполнения данного проекта. Vetrova AA, Lebedeva TS, Saidova AA, Kupaeva DM, Kraus YA, Kremnyov SV. From apolar gastrula to polarized larva: Embryonic development of a marine hydroid, Dynamena pumila. Developmental Dynamics. 2021;1-31. doi:10.1002/dvdy.439, WoS Q1 Таким образом, большая часть запланированных работ на 2021 год успешно выполнена, а некоторые задачи даже немного расширены. | ||
| 3 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Молекулярные основы морфологического разнообразия архитектуры колоний текатных гидроидных полипов |
| Результаты этапа: Настоящий проект был направлен на проведение комплексного сравнительного исследования молекулярно-генетических механизмов разметки тела на модели колониальных гидроидных полипов с разным типом архитектуры колоний - Dynamena pumila (Linnaeus, 1758) и Gonothyraea loveni (Allman, 1859). Исходя из поставленной цели проекта, его основным результатом является детальная характеристика особенностей пространственно-временной экспрессии сигнальных каскадов Wnt, Bmp и Nodal, выявление функциций отдельных компонентов данных каскадов в регуляции определения архитектуры колониальных гидроидов, а также, обнаружение совершенно новых генов участвующих в молекулярной разметке тела колониальных книдарий. В ходе выполнения проекта нами были собраны и проанализированы транскриптомы из разных частей колонии D. pumila и G. loveni. В ходе анализа полученных транскриптомов мы оценили дифференциальный уровень экспрессии отдельных генов-интереса, большинство из которых участвует в регуляции активности Wnt каскада. Также, методом гибридизации in situ были исследованы пространственные паттерны экспрессии генов компонентов Wnt каскада. Полученные результаты позволили сделать вывод, о том, что при молекулярной разметке колонии гидроидных полипов используется совсем другой репертуар Wnt лигандов, чем при разметке одиночных книдарий, что говорит об эволюционной диверсификации генных регуляторных сетей Wnt каскада, участвующих в установлении и поддержагнии плана тела у книдарий. При исследованиии функций сигнального каскада Nodal, мы показали, что данный молекулярный путь имеет ключевое значение при формировании верхушки роста побега во время метаморфоза и формирования первичной колонии гидроидов, но не играет существенной роли при регенерации. Данный результат не является очевидным, так как обычно считается, что молекулярные механизмы, используемые в нормальном развитии для формирования зачатков организма, также запускаются и используются в процессе репаративной регенерации. Наши результаты позволяют предположить, что это допущение не всегда верно для некоторых организмов или процессов. Были исследованы функции отдельных генов методом нокдауна экспрессии генов с применением shRNA. Исследование было проведено на разных стадиях развития: как на стадии формирования личинки – планулы, так и на взрослых колониях. Были исследованы функции таких генов как Wnt7, sFRP1, Notum, FAT4 и Dlx. Функциональное исследование отдельных компонентов сигнальных каскадов у колониальных гидроидных полипов методом shRNA было проведено впервые. В ходе анализа Hi-Seq данных при «слепом» поиске генов, вероятно вовлеченных в разметку колоний гидроидных полипов мы обнаружили гомеобоксный ген Dlx. Основываясь на данных пространственно-временной экспрессии этого гена и функциональных экспериментах с применением shRNA, мы предположили, что Dlx у гидроидов маркирует границы между ценосарком и остальными частями колонии. Дальнейшие подробные исследования функций данного гена позволили нам сделать вывод, о том, что универсальной и консервативной функцией гомеобоксного гена Dlx, появившегося еще до возникновения билатерально-симметричных животных, скорее всего, является установление границ между зачатками развивающихся организмов, но не формирование выростов стенок тела, как предполагают некоторые авторы. Таким образом, большая часть запланированных работ успешно выполнена, а некоторые задачи даже немного расширены. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".