ИСТИНА

Окислительный стресс (ОКС) играет важную роль в развитии таких социально-значимых заболеваний (СЗЗ), как атеросклероз, сахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, канцерогенез, ревматоидные, нейродегенеративные нарушения (болезни Паркинсона, Альцгеймера). Достоверная диагностика ОКС, биохимические причины этиологии и патогенеза СЗЗ основаны на определении комплекса специальных маркеров – молекул белковой и небелковой природы в биологических объектах. Одной из актуальных фундаментальных задач современной науки является изучение биохимических процессов в условиях, приближенных к физиологическим, то есть получение изображений или наблюдение за динамикой молекулярных событий без физического воздействия или при минимальном вмешательстве в живой организм. Современные достижения молекулярной биологии и развитие высокочувствительных неинвазивных или малоинвазивных методов (лазерной флуоресценции, конфокальной микроскопии, КТ и ПЭТ) стимулировали развитие нового направления – определение или визуализация индивидуальных молекул in vivo и ex vivo. На сегодняшний день существуют несколько ограничений внедрения таких методов из области медико-биологических исследований в широкую практику химического анализа, лабораторной диагностики. К таким ограничениям относятся прежде всего высокая стоимость оборудования, необходимость наличия высоко-квалифицированного персонала; в ряде случаев недостаточная чувствительность и селективность; возможность обнаружения, но не количественного определения маркеров СЗЗ. Одним из перспективных подходов к решению указанных проблем, по мнению авторов проекта, является создание высокочувствительных и селективных оптических сенсорных систем (элементов) для определения маркеров СЗЗ, адаптированных под более простое серийное оборудование (флуоресцентные микроскопы и сканеры, портативные рамановские спектрометры). Следует отметить, что в этой области делаются только первые шаги, в настоящее время в литературе отсутствуют сведения о проведении систематических фундаментальных исследований, и опубликованы лишь единичные результаты разработки и внедрения упомянутых систем в практику химического анализа. Целью настоящего проекта является создание модифицированных хеми- и биораспознающих полимерных материалов как основы оптических (флуоресцентных и комбинационного рассеяния) сенсорных элементов для определения маркеров окислительного стресса и нейродегенеративных заболеваний. Эти сенсорные элементы будут представлять собой устройства, в которых оптическими методами ex vivo или in vivo, без взятия каких-либо биоптатов и/или анализов крови, в доступных для обследования участках тела пациента (на коже, слизистой полости рта и др.) или в клеточных культурах будут оцениваться уровни, динамика накопления во времени ряда маркеров СЗЗ, таких как белковые соединения порфиринового ряда (оксигемоглобин, цитохром, пероксидаза), коллаген соединительной ткани, глюкоза, глутатион, пероксиды различного строения, биогенные амины и некоторые другие.

Oxidative stress (OS) plays an important role in the progressing of such socially significant diseases (SSD) as atherosclerosis, diabetes mellitus, coronary heart disease, carcinogenesis, rheumatoid, neurodegenerative disorders (Parkinson's and Alzheimer's diseases). Reliable diagnosis of OS, biochemical causes of the etiology and pathogenesis of the SSD are based on the determination of a set of special markers - molecules of protein and non-protein nature in biological objects. One of the most important fundamental tasks of modern science consists in the study of biochemical processes under conditions close to physiological ones, that is, obtaining images or observing the dynamics of molecular events without physical or minimal interference with a living organism. Modern achievements in molecular biology and the development of highly sensitive non-invasive or minimally invasive methods (laser fluorescence, confocal microscopy, KT, PET) have given rise to a new direction - the determination or visualization of individual molecules in vivo and ex vivo. To date, there are several limitations to the introduction of such techniques from the field of medical and biological research into the broad practice of chemical analysis, laboratory diagnostics. To such limitations, first of all, the high cost of equipment, the need for highly skilled staff; in some cases, insufficient sensitivity and selectivity; the possibility of detecting, but not determining SSD-markers. One of the promising approaches for solving these tasks in the opinion of the authors of the project is the creation of highly sensitive and selective optical sensor systems (elements) for the identification of SSD-markers, adapted for simpler serial equipment (fluorescence microscopes and scanners, portable Raman spectrometers). Notably, only the first steps are being taken in this area, currently there is no literature on the conduct of systematic fundamental research and there are only a few studies on the development and implementation of such systems in the practice of chemical analysis. The aim of this project will be the development of modified chemi- and bio-recognizing polymeric materials as the basis of optical (fluorescent and Raman scattering) sensor elements for the determination of markers of oxidative stress and neurodegenerative diseases. These sensor elements will be devices in which, ex vivo or in vivo, optically, without taking any biopsies and / or blood tests, in the patient's accessible areas of the patient (skin, oral mucosa, etc.) or cell cultures the levels, dynamics of accumulation over time of a number of SSD markers, such as protein compounds of the porphyrin series (oxyhemoglobin, cytochrome, peroxidase), connective tissue collagen, glucose, glutathione, peroxides of various structures, biogenic amines and some s other.

Будут разработаны подходы к созданию модифицированных хеми- и биораспознающих полимерных материалов с использованием природных полимеров коллагена, хитозана и полилизина как основы оптических (флуоресцентных и комбинационного рассеяния) сенсорных элементов для определения маркеров окислительного стресса и нейродегенеративных заболеваний в различных биообъектах в целях клинической и лабораторной диагностики (Веселова И.А., Шеховцова Т.Н). Будут подобраны условия получения однородных, воспроизводимых по свойствам и толщине полимерных покрытий на основе природных полимеров коллагена, хитозана и полилизина на поверхности предметных оптических стекол и планшетах для микроскопических исследований (Еремина О.Е., Македонская М.И.). Будут проведены систематические исследования их морфологии, стабильности при хранении и при проведении экспериментов, приближенных к работе с реальными объектами (Еремина О.Е., Македонская М.И., Филина М.А., Михайлова А.М., Зеленецкая А.С.). Будут проведены работы по адаптации полимерных покрытий уже на стадии проведения фундаментальных исследований и конструкторских разработок оптических сенсорных элементов с использованием модельных соединений флюорофоров под простые серийные приборы, такие как флуоресцентные микроскопы и сканеры, портативные рамановские спектрометры (Еремина О.Е., Македонская М.И., Филина М.А., Михайлова А.М., Зеленецкая А.С.). Будут оптимизированы условия получения, морфология полимерных покрытий на основе коллагена, хитозана и полилизина на поверхности предметных оптических стекол и планшетах для микроскопических исследований в целях получения высокочувствительного и воспроизводимого аналитического сигнала при его регистрации методами флуоресценции и комбинационного рассеяния (Еремина О.Е., Македонская М.И., Веселова И.А.). Будут подготовлены к печати одна/две статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК по результатам эксперимента.

Коллектив заявителей имеет значительный научный задел по созданию твердофазных флуоресцентных и комбинационного рассеяния сенсорных устройств, индикаторных систем на основе гелей и пленок из природных полимеров для определения биологически активных соединений различных классов. За последние несколько лет в результате исследований получены и детально изучены оптические пленки и гели на основе природного полимера – хитозана, с импрегнированными в них распознающими молекулами (индикаторными веществами, комплексами с ионами металлов, ферментами); а также с молекулярными отпечатками. Созданы твердофазные оптические (фотометрические, флуориметрические, комбинационного рассеяния) сенсоры на основе тирозиназы, лакказы, пероксидазы из корней хрена, иммобилизованных в слое полимера хитозана, для определения фенолов, катехоламинов, белков, флавоноидов, серосодержащих соединений, органических пероксидов различного строения. Направленно подобраны оптимальные биокатализаторы, индикаторные вещества, дериватизирующие агенты, условия формирования металлокомплексов, обеспечивающие высокий и воспроизводимый аналитический сигнал пленок и гелей в водных, водно-органических и мицеллярных средах, используемых в подготовке проб реальных объектов. Структура получаемых сенсорных материалов изучена методами спектрофотометрии, флуоресценции, ИК–спектроскопии, масс-спектрометрии, атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии. Предварительные результаты свидетельствуют о возможности чувствительного определения ряда маркеров социально значимых заболеваний на уровне 1 фМ. Коллектив предлагаемого проекта имеет опыт в исполнении проектов.

Будут созданы на основе природных полимеров (коллагена, полилизинов и хитозана) воспроизводимые, нетоксичные, обладающие высокой адгезией к различным биологическим жидкостях и клеткам полимерные покрытия на поверхности оптических носителей (предметных стеклах и планшетах для микроскопических исследований), адаптированных под простое серийно выпускаемое оборудование: флуоресцентные сканеры и микроскопы, портативные рамановские спектрометры. Будут разработаны индикаторные реакции для обнаружения и определения белковых и небелковых маркеров окислительного стресса и нейродегенеративных заболеваний методами флуоресцентной и рамановской спектроскопии. Будут разработаны подходы к импрегнированию хеми- и биораспознающих компонентов флуоресцентных и комбинационного рассеяния индикаторных систем в покрытия на основе коллагена, полилизина и хитозана; особенное внимание в рамках настоящего проекта будет уделяться биосовместимости/нетоксичности используемых компонентов индикаторных систем по отношению к живым тканям, клеточным структурам, биологическим жидкостям. Будут разработаны неинвазивные и малоинвазивные методики для высокочувствительного и селективного определения маркеров окислительного стресса и нейродегенеративных заболеваний на основе созданных в рамках проекта оптических сенсорных элементов и апробированы в анализе живых тканей, биологических жидкостей, клеточных структур in vivo и ex vivo. Эти сенсорные элементы будут представлять собой устройства, в которых оптическими методами ex vivo или in vivo, без взятия каких-либо биоптатов и/или анализов крови, в доступных для обследования участках тела пациента (на коже, слизистой полости рта и др.) или в клеточных культурах будут оцениваться уровни, динамика накопления во времени ряда маркеров СЗЗ, таких как белковые соединения порфиринового ряда (оксигемоглобин, цитохром, пероксидаза), коллаген соединительной ткани, глюкоза, глутатион, пероксиды различного строения, биогенные амины и некоторые другие. Адаптация уже на стадии проведения фундаментальных исследований и конструкторских разработок оптических сенсорных элементов под простые серийные приборы, такие как флуоресцентные микроскопы и сканеры, портативные рамановские спектрометры, в противовес методам лазерной флуоресценции и конфокальной микроскопии, КТ и ПЭТ) имеет большую практическую значимость, а именно позволит перенести in vivo и ex vivo методы неинвазивной и малоинвазивной диагностики из области медико-биологических исследований в биохимические лаборатории. Последнее может быть достигнуто прежде всего за счет значительного снижения стоимости аналитического оборудования, отсутствия необходимости наличия высококвалифицированного персонала; а также возможности не только обнаружения маркеров СЗЗ, но их количественного определения в различных по природе объектах с минимальной травматичностью и без болезненных ощущений у пациента, а также повысить достоверность результатов клинической диагностики из-за минимального вмешательства в матрицу биологических образцов.