ИСТИНА

Васкуляризация ткани, регулируемая стромальными клетками, является критическим этапом в ходе развития, роста, обновления и регенерации ткани после повреждения. Являясь неотъемлемой частью этих процессов, в постнатальном периоде, васкуляризация осуществляется преимущественно путем ангиогенеза, т.е. формирования нового сосуда за счет отрастания от уже существующего в ткани. Стромальные клетки в этой системе играют роль не только «опорного» компонента, но и выполняют важную организующую функцию за счет продукции растворимых факторов роста и компонентов матрикса, создающих градиенты стимулов, которые задают направление роста сосуда. Нами ранее были подробно изучены механизмы, за счет которых мезенхимных стромальных клетки способны активировать и стабилизировать рост кровеносных сосудов и были получены данные о васкуляризации стромальных клеток в виде пласта, имплантированного подкожно Изучая вопросы навигации растущих сосудов, мы установили важную роль GPI-заякоренных белков: Т-кадгерина, эфринов и рецептора урокиназы (uPAR) в выборе направления роста. При этом uPAR, не обладающий внутриклеточным доменом,длительное время не ассоциировался с рецепцией ангиогенных факторов роста, которая осуществляются через рецепторные тирозинкиназы, активирующие внутриклеточный сигналинг после лиганд-зависимой димеризации. Литературные данные о том, что uPAR может связываться с интегринами и другими белками на мембране клеток подсказали нам возможность их участия в рецепции факторов роста, в том числе регулирующих направленный рост сосуда. Большая часть работ в этой области посвящена участию uPAR в регуляции чувствительности к факторам роста в клетках опухолей, однако мы предпочли расширить это представление и на физиологический ангиогенез в нормальных тканях. Данный проект посвящен проверке гипотезы о новом механизме, за счет которого uPAR может вносить вклад в васкуляризацию тканей и направленный рост сосуда. В рамках этой гипотезы мы рассматриваем uPAR как участник и модулятор сигнализации через тирозинкиназные рецепторы, определяющие чувствительность эндотелиоцита к VEGF, который активно продуцируется МСК и другими стромальными клетками. Проект тесно связан с основной темой диссертационной работы аспиранта и посвящен фундаментальному аспекту регуляции роста кровеносных сосудов при участии uPAR. В проекте предлагается на модели сокультивирования эндотелия с клеточными пластами, имитирующими стромальный компонент ткани, изучить вклад uPAR в чувствительность эндотелия к VEGF, обеспечивающему направленный рост сосуда. В ходе работы планируется показать изменение ангиогенного ответа при подавлении экспрессии uPAR, а также изучить ее влияние на появление среди эндотелиоцитов "ведущей клетки", что свидетельствует об активации направленного роста сосуда и чувствительности клеток к VEGF. В проекте также будет исследована роль интегрина-В1, который может участвовать в реализации прямого взаимодействия uPAR с рецепторами VEGF. Таким образом, реализация проекта раскрывает новый механизм участия рецептора урокиназы в ангиогенезе путем обеспечения чувствительности эндотелия к факторам роста, продуцируемым стромальными клетками. Результаты проекта расширят наше представление о uPAR, как о плеотропном GPI-заякоренном регуляторе межклеточных коммуникаций и важном участнике васкуляризации тканей.

Vascularization of tissue regulated by stromal cells, is a critical stage of development, growth, renewal and regeneration of tissue after injury. Being an integral part of these processes, in the postnatal period, vascularization is carried out mainly by angiogenesis, i.e. the formation of a new vessel due to the growth from the already existing in the tissue. Stromal cells in this system play the role of not only the “supporting” component, but also perform an important organizing function due to the production of soluble growth factors and matrix components, creating gradients of stimuli that determine the direction of growth of the vessel. We have previously studied in detail the mechanisms by which mesenchymal stromal cells are able to activate and stabilize the growth of blood vessels, and data were obtained on the vascularization of stromal cells in the form of a layer implanted subcutaneously. Studying the issues of navigation of growing vessels, we established the important role of GPI-anchored proteins: T-cadherin, ephrin and urokinase receptor (uPAR) in choosing the direction of growth. At the same time, uPAR, which does not possess an intracellular domain, has not been associated for a long time with the reception of angiogenic growth factors, which are carried out through receptor tyrosine kinases that activate intracellular signaling after ligand-dependent dimerization. The literary evidence that uPAR can bind to integrins and other proteins on the cell membrane prompted us to take part in the reception of growth factors, including those regulating the directional growth of the vessel. Most of the work in this area is devoted to the participation of uPAR in the regulation of sensitivity to growth factors in tumor cells, however, we preferred to extend this concept to physiological angiogenesis in normal tissues. This project is devoted to testing the hypothesis of a new mechanism by which uPAR can contribute to the vascularization of tissues and the directional growth of the vessel. As part of this hypothesis, we consider uPAR as a participant and a signaling modulator through tyrosine kinase receptors, which determine the sensitivity of the endotheliocyte to VEGF, which is actively produced by MSCs and other stromal cells. The project is closely related to the main theme of the dissertation of a graduate student and is devoted to the fundamental aspect of the regulation of the growth of blood vessels with the participation of uPAR. The project proposes on the model of endothelial cocultivation with cell layers that mimic the stromal component of the tissue, to study the contribution of uPAR to the sensitivity of the endothelium to VEGF, which provides directional growth of the vessel. In the course of the work, it is planned to show a change in the angiogenic response in suppressing the expression of uPAR, as well as to study its effect on the appearance of the “leading cell” among endotheliocytes, which indicates the activation of directional vessel growth and cell sensitivity to VEGF. The project will also explore the role of integrin-B1, which can participate in the implementation of the direct interaction of uPAR with VEGF receptors. Thus, the implementation of the project reveals a new mechanism for the involvement of the urokinase receptor in angiogenesis by ensuring the sensitivity of the endothelium to growth factors produced by stromal cells. The results of the project will expand our understanding of uPAR as a pleotropic GPI-anchored intercellular communication regulator and an important participant in vascularization of tissues.

Помимо отработки и характеристики модели сокультивирования эндотелиальных клеток и клеток стромы в виде пластов будет получен ряд важных научных результатов, касающихся процессов ангиогенеза и механизмов его регуляции. - будут показаны тканеспецифичные различия ангиогенного ответа, вызванные взаимодействием клеток эндотелия с клетками стромы из разных тканей (кожа; жировая ткань) - будет изучена роль uPAR в активации ангиогенеза под влиянием факторов роста (в частности, VEGF), секретируемых стромальными клетками - будет показана важность uPAR для эффективного формирования "ведущей" клетки эндотелия и васкуляризации стромы. В связи с важностью соотношения VEGFR1 и VEGFR2 для поддержания фенотипа "ведущей" клетки мы предполагаем, что подавление экспрессии uPAR вызовет падение сигнализации через VEGFR2, что приведет к уменьшению инвазии капилляров в толщу стромального пласта. - будет установлено влияние uPAR и интегрина-В1 на активацию тирозинкиназной сигнализации и показаны изменения васкуляризации стромы, возникающие при подавлении их экспрессии. Мы ожидаем снижения чувствительности к VEGF165 (в т.ч. внесенному экзогенно в модельную систему) и нарушения процесса формирования "ведущей" клетки, что приведет к уменьшению формирования капиллярных структур и их стабильности при длительном сокультивировании со стромальными клетками.

Под руководством В.А. Ткачука исследования физиологической роли системы урокиназы и урокиназного рецептора ведутся более 25 лет. В ходе работы был получен целый ряд важных научных результатов, в том числе приоритетных и давших развитие новым научным направлениям. В ходе диссертационной работы асп. Н.А. Александрушкиной в опытах на животных мы показали васкуляризацию пласта из мезенхимных стромальных клеток (МСК) после подкожной имплантации. С учетом ранее полученных нами данных о роли uPAR в выборе направления роста кровеносного сосуда и данных о том, что у животных, дефицитных по гену plaur, кодирующему uPAR, имеются нарушения процесса ранозаживления со снижением васкуляризации в зоне регенерации, мы предположили возможность участии uPAR в модуляции чувствительности эндотелия к ангиогенным факторам роста, генерируемым стромальными клетками. Это может осуществляться ща счет регуляции активности рецепторных тирозинкиназ за счет их прямого взаимодействия с GPI-заякоренным uPAR на мембранах эндотелиоцитов. Даннное предположение косвенно подкрепляется нашими собственными данными о способности uPAR регулировать чувствительность к эпидермальному фактору роста EGF за счет влияния на димеризацию его тирозинкиназного рецептора (EGFR).

Окончание проекта запланировано в 2021 г