| 1 |
1 июля 2016 г.-30 июня 2017 г. |
Исследование взаимного влияния основных участников метастатического адгезионного каскада |
| Результаты этапа: В ходе выполнения данного этапа работы получены экспрессионные конструкции, содержащие ген слитого с GFP белка, несущего различное количество тандемных повторов из области VNTR муцина MUC1 человека и FLAG-эпитоп (на N-конце). Данными конструкциями трансфицированы клетки линии HT-29, обладающих низким метастатическим потенциалом. В результате этого были получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие гены вышеописанных слитых белков. Уровень экспрессии белков в клетках был проанализирован при помощи проточного цитофлуориметра путем оценки интенсивности флуоресценции клеток в популяции. Также определена локализация рекомбинантных белков в клетках полученных стабильных линий. |
| 2 |
1 июля 2017 г.-30 июня 2018 г. |
Исследование взаимного влияния основных участников метастатического адгезионного каскада |
| Результаты этапа: В ходе выполнения работы была проведена оценка влияния условий и продолжительности культивирования клеток полученных на предыдущем этапе стабильных линий на экспрессию рекомбинантных белков и презентацию их на поверхности клеток.Также было исследовано наличие гликозидных эпитопов sialyl Lewisa у рекомбинантных белков, выделенных на анти-FLAG агарозе. Полученные данные позволили выявить корреляцию между увеличением количества тандемных повторов в белке и снижением уровня содержания гликозидных эпитопов sialyl Lewisa в пересчете
на 1 повтор. Проведена оценка влияния условий культивирования клеток стабильных линий на
гликозилирование рекомбинантных белков. В ходе этой оценки было установлено, что культивирование на обедненной среде приводит к уменьшению рекомбинантного белка на поверхности, а при пролонгации такого культивирования - к снижению уровня экспрессии. При помощи прямой и инвертированной моделей эндотелия был исследован метастатический потенциал клеток полученных стабильных линий, а именно: оценена их подвижность, инвазивность, способность к интравазации и экстравазации |
| 3 |
1 июля 2018 г.-30 июня 2019 г. |
Исследование взаимного влияния основных участников метастатического адгезионного каскада |
| Результаты этапа: Для клеток полученных стабильных линий была проведено сравнение их способности к адгезии к белкам внеклеточного матрикса — витронектину и фибронектину, определен уровень интегринов αvβ3 и α5β1 на клеточной поверхности, выявлен характер распределения данных рецепторов на мембране относительно областей распределения рекомбинантных белков. Наконец, у данных клеток было проведено сравнение способности к подвижности и интравазации, в результате которого было установлено, что при одинаковой способности к подвижности у клеток всех полученных стабильных линий, клетки линии HT-29_TR20 демонстрировали повышенную способность к интравазации.
Опираясь на полученные результаты и данные литературы, можно предположить, что презентация на поверхности клеток муцина MUC1, несущего 20 тандемных повторов, приводит к кластеризации и активации интегриновых рецепторов αvβ3 и α5β1 и, как следствие, усилению адгезии к белкам внеклеточного матрикса, что в свою очередь, приводит к увеличению у таких клеток способности к интравазации. Белки, несущие меньшее количество тандемных повторов (1-12), по-видимому, не способны активировать интегриновые рецепторы, а, наоборот, создают затруднения для их связывания с белками ECM, следствием чего является низкая способность к интравазации. |
