Каспазы: функциональное значение в норме и патологииНИР

Caspases: functional significance in health and disease

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 8 мая 2019 г.-31 декабря 2019 г. Каспазы: функциональное значение в норме и патологии
Результаты этапа: 1. Была создана система анализа режимов эволюции семейства каспаз, в основе которой лежит Марковское моделирование эволюции белков и анализ изменения всех известных физико-химических свойств аминокислот. 2. С помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 были созданы мутантные мыши имеющие делеции 7 нуклеотидов и 20 нуклеотидов в экзоне 5 каспазы-2. 3. Выбрана экспериментальная модель для исследования роли каспазы-2 при нарушении митоза. Она включала клетки линии Caov-4 wild type (wt), Caov4-shRNA caspase-2 (sh), CRISPR/Cas9 control Caov-4 (с/с) и caspase-2 knockout Caov-4 (CRISPR/Cas9) (ko). Клетки были обработаны химиотерапевтическими агентами цисплатином в концентрации 5 мкM, колцемидом в концентрации 10 мкг/мл, доксорубицином в концентрации 600 нM и этопозидом в концентрации 34 мкМ в течение 24 часов. В качестве контроля использпвались необработанные клетки каждой линии.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Каспазы: функциональное значение в норме и патологии
Результаты этапа: 1. Проведен анализ замен аминокислот к консервативным и исследование скоростей изменения физико-химических свойств каспаз. Вычислена частота изменений этих показателей между всеми альтернативными наследственными последовательностями узлов дерева. Выявлена ассоциация между наличием определённых каспаз у грызунов, степенью аминокислотных замен и продолжительностью жизни. 2. Оказалось, что в образцах тканей мышей del7 и del20 по сравнению с мышами дикого типа (wt) мРНК каспазы-2 не было обнаружено. Таким образом, можно сделать заключение, что были получены два варианта полного нокаута каспазы-2 в линии мышей FVB/N. 3. Патоморфологические характеристики были описаны для 50 мышей с генотипом del7, del20 и wt, из которых 23 мыши были дикого типа и 27 были нокаутами по каспазе-2. Согласно сделанному заключению регулярные и специфические патоморфологические изменения, характерные для органов и тканей нокаутных животных, не касающихся половой сферы, не выявлены. Яичники нокаутных по каспазе-2 самок кардинально отличаются от яичников самок wt: более половины молодых самок del7 и почти у всех молодых самок del20 отмечалась частичная или полная редукция ооцитов (иногда с сохранившимися фолликулярными структурами) с избыточным развитием (гиперплазией) желтых тел по сравнению с животными дикого типа. 4. Установлено, что белок р53 стимулирует развитие предстадии гибели клеток. 5. Показано, что уровень γН2АХ в нокаутных по каспазе-2 клетках был снижен по сравнению с нормальными клетками после синхронизации клеток в фазе G1/S, при этом данное различие не было детектировано для клеток, синхронизированных в G2/M фазе. Это говорит о важности каспазы-2 для детекции повреждений ДНК именно в фазе синтеза. 6. Показано, что эндогенный Mcl-1S, а также Mcl-1S, экспрессируемый плазмидой, оказываются в ядерных фракциях, демонстрируя способность белка проникать в ядро. Более того, ядерное накопление было обнаружено после выхода из блока клеточного цикла, что может указывать на важность Mcl-1S для ядерных функций. Дополнительные исследования: 1. Созданы линии клеток А549 и Н23, в которых экспрессия BNIP3 была выключена с использованием методики CRISPR/Cas9. Выяснилось, что нокаут BNIP3 приводил к угнетению как базального, так и максимально возможного дыхания. Показано, что выход цитохрома с из митохондрий в клетках с нокаутом и нокдауном по BNIP3 был более выражен, чем в контрольных клетках. 2. Собрана информация о механизмах ПГК и представлена в структурированном и машиночитаемом виде. Показана на некоторых примерах приложений, интеграция и анализ данных в контексте карты дает представление не только о дерегулируемых процессах ПГК в исследуемом типе заболевания, но и указывает на наиболее активных участников, которые могут быть в будущем являться терапевтической мишенью. На этом этапе планировалось опубликовать три статьи в научных журналах. В результате исследования опубликовано 7 статей, из них 4 в журнале Биохимия и три в журналах, входящих в Q1: Frontiers Cell Dev. Biol. (I.F.=5.2), Cancers (I.F.=6.2), Intern. Rev. Cell Mol. Biol. (I.F.= 3.8). По материалам проекта сделано 9 докладов на международных и национальных конференциях. За публикации, поддержанные настоящим грантом 2 участника проекта были признаны лауреатами Конкурса МГУ в номинации «Выдающиеся статьи».
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Каспазы: функциональное значение в норме и патологии
Результаты этапа: В течение последнего года нами проведен филогенетический анализ новых генов и выявление дивергентных групп в различных семействах грызунов. На основании полученных данных выявлены сигнальные пути, характерные для низших групп грызунов с высокой продолжительностью жизни. В результате анализа нокаутных по каспазе-2 мышей установлено, что расщепление генотипа casp2-KO/casp2-KO против casp2-KO/wt и wt/wt происходит строго согласно закону Менделя. Уровень сперматогенеза у окаутых самцов не отличается от контроля. Детальный анализ массы отдельных органов у самок и самцов casp2-KO показал, что масса тела достоверно отличается в сторону увеличения только у самок линии с делецией 20. Необходимо отметить, что у самок обеих линий (del7 и del20) было достоверно повышено количество висцерального жира. Aнализ органов половой системы самок показал, что масса яичников и матки у нокаутных самок с делецией 20 достоверно увеличивается. Уровень тестостерона достоверно увеличивается у нокаутных самцов с делецией 20 нуклеотидов. Эстрадиол и прогестерон у нокаутных самок достоверно не отличались от самок дикого типа, хотя имели тенденцию к повышению и понижению, соотвественно. Таким образом, отличие половых гормонов наблюдалось только в случае самцов с делецией 20 нуклеотидов. У самок дикого типа (wt) и нокаутных по каспазе-2 (делеции 7 и 20 нуклеотидов) возрастом около 6 месяцев в условиях изолированного содержания ежедневно на протяжении не менее 3 недель брали смывы из влагалища. Практически все контрольные самки циклировали (12 из 14), в то время как доля циклирующих самок с делециями d7 и d20 была значительно ниже (5 из 12 и 6 из 13 соответственно). Различий в длительности эстрального цикла обнаружено не было. Далее нами был проведен анализ вынашиваемости беременности, который показал, что 3 самки из 7 мутации d7/d7 родили после подсадки эмбрионов, а из 6 самок мутации d20/d20 не родили ни одна из них. Данный результат свидетельствовал о том, что нокаутные по каспазе-2 самки имеют проблемы не только с созреванием яйцеклеток, но и с вынашиваемостью беременности. Анализ влияния наличия р53 на индукцию аутофагии после развития митотической катастрофы показал, что внутриклеточная локализация данннного белка является приципиальной для его участия в развитии аутофагии после митотической катастрофы.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".