ИСТИНА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в настоящей работе проанализированы эффективность и безопасность клеточно-опосредованной генной терапии БТС и БС. Были разработаны две стратегии. Первая представляет собой применение мононуклеарных клеток пуповинной крови (МКПК), генетически модифицированных с помощью бицистронного лентивирусного вектора, кодирующего кДНК генов α- и β-субъединиц β-гексозаминидазы А (HexA), разделенные нуклеотидной последовательностью P2A пептида (МКПК-HEXA-HEXB). Функциональность бицистронной конструкции проанализирована в культуре клеток HEK293T и МКПК человека. Показано, что ферментативная активность HexA в кондиционированной среде генетически модифицированных клеток HEK293T-HEXA-HEXB и МКПК-HEXA-HEXB выше в 23 и 8 раз соответственно, чем в кондиционированной среде нативных клеток. С помощью вестерн-блот-анализа выявлено, что МКПК-HEXA-HEXB секретируют как полностью разделенные белки HEXA и HEXB, так и нерасщепленный белок, содержащий HEXA + HEXB, соединенные Р2А пептидом. Проведено внутривенное введение генетически модифицированных МКПК-HEXA-HEXB лабораторным крысам линии Вистар и проанализированы ферментативная активность HexA в плазме крови подопытных животных, а также клеточность органов иммунной системы (селезенка, тимус, костный мозг, лимфоузлы). Показано статистически значимое повышение ферментативной активности HexA в плазме крови лабораторных крыс на 6 и 9 дни (в 2.5 и 3.4 раза соответственно) после введения МКПК-HEXA-HEXB по сравнению с контрольной группой, которой внутривенно вводили физиологический раствор. При этом клеточность исследуемых органов осталась неизменной. Таким образом, показана функциональность бицистронной генетической конструкции, кодирующей кДНК генов HEXA и HEXB, разделенные нуклеотидной последовательностью P2A пептида, in vitro и in vivo. Мы предполагаем, что, благодаря естественной способности МКПК преодолевать биологические барьеры, такая стратегия может позволить восстановить активность недостающего фермента в ЦНС пациентов с GM2-ганглиозидозом. Вторая стратегия представляет собой применение мезенхимных стволовых клеток (МСК), генетически модифицированных с помощью аденоассоциированных вирусов, кодирующих кДНК генов α- и β-субъединиц (МСК-HEXA-HEXB). МСК-HEXA-HEXB содержали высокие уровни копий мРНК кодон-оптимизированных генов HEXA и HEXB. Подтверждено присутствие белков HEXA (70 кДа) и HEXB (30 кДа). В КС МСК-HEXA-HEXB показано повышение ферментативной активности HexA в 5.3–8.6 раза сравнительно с контрольными клетками. Была выявлена эффективность кросс-коррекции дефицита HexA в мутантных МСК (мутМСК) пациента с БТС в результате совместного культивирования с человеческими МСК-HEXA-HEXB. После перекрестной коррекции дефицита HexA мутМСК содержали мРНК генов HEXA и HEXB. Наблюдается присутствие белков HEXA и HEXB в мутМСК после кросс-коррекции. Концентрация HEXA в мутМСК после кросс-коррекции повышается в 2.25 раза сравнительно с образцом нативных мутМСК. Внутривенное введение крысиных МСК-HEXA-HEXB приводит к увеличению уровня фермента HexA в плазме и органах крыс, в том числе головном и спинном мозге, при этом не вызывает иммунного ответа или повреждения органов животных. Полученные данные позволяют предположить безопасность и эффективность разработанных способов клеточно-опосредованной генной терапии GM2-ганглиозидозов. Полученные в ходе экспериментальных работ результаты привели к следующим основным выводам: 1. Разработана бицистронная генетическая конструкция, кодирующая кодон-оптимизированную комплементарную ДНК (кДНК) генов HEXA и HEXB, и проведено ее клонирование в лентивирусный вектор (LV-HEXA-HEXB). Разработаны генетические конструкции на основе аденоассоциированного вируса, кодирующие кодон-оптимизированную кДНК генов HEXA или HEXB (AAV-HEXA и AAV-HEXB). 2. Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, генетически модифицированные рекомбинантным лентивирусом LV-HEXA-HEXB (МКПК-HEXA-HEXB), и мезенхимные стволовые клетки человека, генетически модифицированные рекомбинантными аденоассоциированными вирусами AAV-HEXA и AAV-HEXB (чМСК-HEXA-HEXB), экспрессируют функционально активную β-гексозаминдазу А (HexA). МКПК-HEXA-HEXB, генетически модицированные бицистронным вектором LV-HEXA-HEXB, синтезируют нерасщепленный фьюжн-продукт α- (HEXA) и β-субъединиц (HEXB), сшитых через P2A пептид. 3. Ко-культивирование мутантных мезенхимных стволовых клеток пациента с болезнью Тея — Сакса (мутМСК) с чМСК-HEXA-HEXB приводит к кросс-коррекции дефицита HexA в мутМСК. После кросс-коррекции мутМСК содержат высокий уровень копий мРНК генов HEXA и HEXB. Концентрация HEXA в мутМСК после кросс-коррекции повышается в 2.25 раза сравнительно с образцом нативных мутМСК. Путем иммуноцитохимического анализа показано присутствие белков HEXA и HEXB в мутМСК после кросс-коррекции. 4. Внутривенное введение мононуклеарных клеток пуповинной крови человека со сверхэкспрессией генов HEXA и HEXB приводит к увеличению ферментативной активности HexA в плазме подопытных крыс. Наиболее высокая ферментативная активность HexA наблюдалась на 6 и 9 сутки после введения генетически модифицированных клеток. На 6 день после введения МКПК-HEXA-HEXB ферментативная активность HexA была в 2.5 раза выше, на 9 день в 3.4 раза выше по сравнению со значением активности фермента HexA в плазме у контрольных животных, которым вводили физиологический раствор. Не обнаружено изменений в клеточности органов иммунной системы и цитокиновом профиле сыворотки крови подопытных крыс. 5. Внутривенное введение мезенхимных стволовых клеток крысы со сверхэкспрессией генов HEXA и HEXB человека (кМСК-HEXA-HEXB) приводит к увеличению ферментативной активности HexA в плазме крови крыс через 1, 2 и 28 дней после введения кМСК-HEXA-HEXB. В гомогенатах внутренних органов крыс через 24 и 48 часов после внутривенного введения кМСК-HEXA-HEXB обнаружены копии мРНК кодон-оптимизированных генов HEXA и HEXB и повышение ферментативная активность HexA. В головном мозге крыс выявлены клетки со сверхэкспрессией HEXB. Не обнаружено изменений в биохимических показателях крови, клеточности органов иммунной системы, лейкоформуле, цитокиновом профиле плазмы крови и патогистологических показателях подопытных крыс.