ИСТИНА

Основные цели и задачи исследования Целью данной работы является изучение гемопоэтических, иммуномодулирующих и противоопухолевых свойств рекомбинантного циклофилина А человека. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить роль рчЦфА в регенерации кроветворной и иммунной систем организма путем анализа его влияния на субпопуляционный состав клеток костного мозга, крови и органов иммунной системы экспериментальных животных в норме и после воздействия цитостатика и облучения. 2. Оценить влияние рчЦфА на развитие иммунного ответа у интактных животных и у животных, подвергнутых воздействию цитостатика и облучения. 3. Оценить влияние рчЦфА на рост перевиваемых опухолевых штаммов различного гистогенеза в системе in vivo без воздействия и на фоне воздействия химиотерапевтического препарата. 4. Разработать модель для изучения роли ЦфА как фактора микроокружения ГСК путем создания трансгенных мышей с повышенной экспрессией ЦфА мыши в остеобластах. Научная новизна исследования Впервые показано, что рчЦфА в фармакологических концентрациях не вызывает значительных изменений гомеостаза гемопоэтической системы организма. Впервые выявлено сенсибилизирующее действие высоких доз рчЦфА. Впервые показано, что рчЦфА является фактором активации и пролиферации В-лимфоцитов и митогеном для активированных Т-клеток. В системе in vivo выявлено иммуномодулирующее действие исследуемого белка, направленное на стимуляцию гуморального и противоопухолевого иммунного ответа. Впервые показана способность рчЦфА восстанавливать кроветворную и иммунную системы организма после воздействия высоких доз цитостатиков и облучения. Впервые в системе in vivo на ряде моделей показана противоопухолевая активность рчЦфА. Впервые в системе in vivo показана способность рчЦфА ингибировать постоперационное метастазирование опухоли. Впервые в системе in vivo показано аддитивное действие рчЦфА и 5ФУ, приводящее к усиленному подавлению роста опухоли. Разработана уникальная модель трансгенных мышей с индуцируемой гиперэкспрессией ЦфА в остеобластах для изучения роли данного белка как фактора микроокружения ГСК. Впервые показано и изучено эмбриотоксическое действие высоких доз нативного ЦфА мыши и рчЦфА. Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость работы: полученные результаты значительно расширили представления о функциональной активности ЦфА. В рамках данной работы выявлены и изучены свойства рчЦфА как: • гемопоэтического фактора, участвующего в восстановлении кроветворной и иммунной систем организма после различных стрессовых воздействий (в частности, воздействия цитостатика и облучения); • иммудомодулирующего фактора; • противоопухолевого фактора; • эмбриотоксического фактора. Практическая значимость работы: полученные результаты открывают широкие перспективы для использования в клинической практике лекарственных средств на основе рчЦфА: • в качестве поддерживающей терапии заболеваний, сопровождающихся лейкопенией; • в качестве иммуномодулятора для коррекции иммунодефицитных состояний; • в качестве самостоятельного противоопухолевого агента; • в составе комбинированной лекарственной терапии онкологических заболеваний. Методология и методы исследования В исследованиях использовали рекомбинантный циклофилин А человека (рчЦфА) (продуцент - E. coli), который вводили животным подкожно или внутрибрюшинно однократно или в течение 3 - 7 дней. Для изучения влияния рчЦфА на гомеостаз кроветворной системы интактного организма проводили подсчет миелограмм костного мозга и анализировали субпопуляционный состав клеток периферической крови мышей с использованием флуоресцентно меченых антител на проточном цитофлуориметре FACS CantoII (BD, США). Для исследования иммуномодулирующего действия рчЦфА проводили оценку уровня гуморального и клеточного иммунного ответа на модельный антиген по подсчету количества антителообразующих клеток (АОК) методом Ерне и в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) соответственно. Митогенные и сенсибилизирующие свойства рчЦфА оценивали in vitro в реакции бласттрансформации (РБТ). Для исследования роли рчЦфА в регенерации гемопоэтической и иммунной систем организма при вторичных иммунодефицитах анализировали субпопуляционный состав клеток костного мозга, периферической крови, селезенки и тимуса сублетально облученных мышей и мышей, обработанных цитостатиком (5-фторурацилом, 5ФУ), методом проточной цитофлуориметрии. Влияние рчЦфА на восстановление функциональной активности иммунной системы животных со вторичным иммунодефицитом оценивали в системах in vivo методом Ерне и по реакции ГЗТ и in vitro в РБТ и смешанной культуре лимфоцитов. Исследование противоопухолевой активности рчЦфА проводили в системе in vivo на моделях перевиваемых опухолевых штаммов карциномы легкого Льюис (LLC), меланомы В16, аденокарциномы молочной железы Ca755 и рака шейки матки РШМ-5 [44]. Изучение сочетанного действия рчЦфА и 5ФУ при противоопухолевой терапии проводили in vivo на модели перевиваемого рака шейки матки РШМ-5. Оценку антиметастатического действия рчЦфА проводили на модели in vivo постоперационного метастазирования LLC. Влияние рчЦфА на уровень экспрессии различных генов в тканях первичной опухоли исследовали in vivo на модели перевиваемой меланомы В16 методом ПЦР в реальном времени. Влияние рчЦфА на ангиогенез опухоли исследовали in vivo на модели перевиваемой меланомы В16 методом иммуногистохимии. Роль рчЦфА в развитии противоопухолевого иммунного ответа оценивали в аллогенной системе отторжения лимфомы EL-4 (KbDb) мышами линии B10.D2(R101) (KdI-AdI-EdDb) и трансгенной линии 1D1b (KdI-AdI-EdDb). Динамику элиминации опухолевых клеток и субпопуляционный состав клеток брюшной полости и селезенки иммунных животных оценивали методом проточной цитофлуориметрии. Для создания генетической конструкции для получения трансгенных мышей полноразмерную кДНК ЦфА мыши (мЦфА) клонировали в экспрессионный вектор pUC18. Модификацию генетической конструкции pUC18-мЦфА проводили путем вставки последовательности СТОП - кассеты, фланкированной loxP - сайтами, между первым интроном промотора и последовательностью кДНК мЦфА. Первичных трансгенных мышей получали методом микроинъекции экспрессионной конструкций pUC18-мЦфА или pUC18 - STOP - мЦфА в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Наличие трансгена в геноме животных подтверждали методом ПЦР. Для получения чистой трансгенной линии проводили 6 возвратных скрещиваний первичных трансгенных мышей с мышами инбредной линии C57BL/6. Эмбриотоксические свойства рчЦфА изучали на беременных самках F1(CBA/Lac x C57BL/6), которым вводили белок в доимплантационный период, период органо- или фетогенеза. Морфологические пороки развития эмбрионов оценивали визуально при помощи бинокуляра. Для изучения влияния рчЦфА на процессы оссификации скелеты эмбрионов окрашивали ализариновым красным по методике Доусона и анализировали зоны оссификации при помощи стереомикроскопа.