ИСТИНА

Проведен анализ применимости различных методов стабилизации для повышения термостабильности ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101. Показана возможность успешного использования метода гидрофобизации  спиралей для повышения термостабильности исследуемого фермента. Получено 10 точечных мутантов и изучены их кинетические свойства и термостабильность. Показано, что единичные точечные мутации обеспечивают повышение термостабильности ФДГ из Pseudomonas sp.101 в среднем от 9 до 25 %. Объединение положительных мутаций в 2 двойных и одни четверной мутанты демонстрирует аддитивность стабилизирующих эффектов для отдельных точечных замен и приводит к повышению стабильности ФДГ - на 28 - 40% и на 70% для двойных и четверного мутантов, соответственно, без изменения их кинетических параметров. Показана возможность применения метода вытеснения воды из полостей белковой глобулы для повышения термостабильности бактериальной формиатдегидрогеназы. В результате детального анализа четвертичной структуры белковой глобулы ФДГ были получены 2 точечных мутанта, которые приводят к стабилизации ФДГ в 1,4 и 4 раза соответственно. Объединение этих точечных мутантов в двойной мутант привело к стабилизации ФДГ в 5 раз без изменения кинетических параметров. Объединены все положительные мутаций в шестерной мутант, что привело к получению мутанта ФДГ по своей стабильности превосходящий фермент дикого типа при 65 оС в 9 раз. Показано, что при объединении мутаций наблюдается абсолютная аддитивность стабилизирующих эффектов. Исследована температурная зависимость констант скорости инактивации нативной ФДГ и ее мутантов. Показано, что процесс термоинактивации может быть описан в соответствии с теорией активированного комплекса, а увеличение термостабильности обусловлено в основном увеличением энтропийной составляющей величины изменения свободной энергии активации процесса термоденатурации фермента. Изучены кинетические параметры мутантов и показано, что даже многоточечные мутанты не влияют на кинетические свойства ферментов.