|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ПсковГУ |
||
Белковая инженерия оксидазы D-аминокислот для повышения химической стабильности ферментадипломная работа (Специалист)
- Научные руководители: Тишков В.И., Голубев Игорь Владимирович
- Автор: Атрошенко Денис Леонидоваич
- Тип: Специалист
- Организация, в которой проходила защита: МГУ имени М.В. Ломоносова
- Год защиты: 2015
- Аннотация: Оксидаза D-аминокислот (DAAO) – FAD-зависимая оксидоредуктаза, которая стереоспецифично окисляет D-аминокислоты с образованием α-кетокислоты, иона аммония и пероксида водорода. Данный фермент играет важную физиологическую роль и используется в промышленности. Самое крупнотоннажное производство с участием DAAO – это двухстадийная конверсия природного антибиотика цефалоспорина С (CPC) в 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АЦК). Из этого соединения производится более половины всех полусинтетических антибиотиков цефалоспоринового ряда. Среди известных природных оксидаз самую высокую активность с CPC имеет DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO). Однако, одним из главных ограничений при использовании ферментов в промышленности является их низкая операционная стабильность. Для DAAO операционная стабильность в основном определяется действием пероксида водорода, так как он является продуктом реакции, катализируемой DAAO. В результате взаимодействия фермента с пероксидом водорода происходит окисление DAAO и его инактивация. Целью данной работы является изучение стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода и получение мутантных форм TvDAAO для повышения окислительной стабильности. В результате данной работы был проведен анализ структуры оксидазы TvDAAO. В дополнение к ранее полученного в нашей лаборатории мутанта TvDAAO Met104Leu методом направленного мутагенеза в данной работе получены две новые мутантные TvDAAO с заменами Met156Leu и Met209Leu. Проведены экспрессия, выделение и очистка мутантных TvDAAO Met104Leu, TvDAAO Met156Leu, TvDAAO Met209Leu и TvDAAO дикого типа. Получены высокоочищенные препараты ферментов в активной растворимой форме, изучен спектр субстратной специфичности, определены кинетические параметры с различными D-аминокислотами. Введение замен привело к изменению профиля субстратной специфичности TvDAAO. Изучена температурная стабильность новых мутантных TvDAAO. Показано, что замена Met209Leu привела к небольшому снижению температурной стабильности фермента, в то время как введение замены Met156Leu привело к повышению стабильности TvDAAO в 2-3 раза по сравнению с ферментом дикого типа. Разработана методика определения стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода. Изучена окислительная стабильность TvDAAO c заменами Met104Leu, Met156Leu и Met209Leu и TvDAAO дикого типа. Установлено, что введение замен незначительно повлияло на окислительную стабильность фермента.
- Добавил в систему: Тишков Владимир Иванович