ИСТИНА

Цитохромоксидаза ba3-типа из Thermus thermophilus относится к обширному семейству структурно родственных гем-медных терминальных оксидаз. Фермент содержит 4 редокс-центра: CuA, низко-спиновый гем b и биядерный, кислород-восстанавливающий центр, включающий в себя CuB и гем а3. Цитохром ba3 катализирует процесс восстановления кислорода в воду, сопрягая его с созданием электрохимического трансмембранного градиента протонов, который впоследствии используется для синтеза АТФ. В работе с микросекундным временным разрешением были изучены кинетика фотоиндуцированной генерации мембранного потенциала оксидазы ba3-типа и параллельные спектральные изменения в области полос поглощения гемов. Для фотоинициации реакции использовались два подхода: 1) одноэлектронное восстановление окисленной цитохромоксидазы с помощью фотоактивного комплекса трис(бипиридил)рутения (Rubpy); 2) фотолиз комплекса СО с восстановленной цитохромоксидазой в присутствии кислорода, с последующим быстрым окислением в режиме одного оборота фермента. При одноэлектронном фотовосстановлении окисленной ba3 оксидазы с помощью Rubpy (O->E переход) наблюдаются две фазы генерации мембранного потенциала. Быстрая фаза отражает электрогенный перенос электрона с CuA на гем b, в то время как медленная фаза по всей вероятности обусловлена электрогенным переносом протона, сопряженным с реокислением гема b биядерным центром. В быстрой кинетике окисления кислородом полностью восстановленной ba3 оксидазы были разрешены четыре каталитических промежуточных состояния биядерного фермента. Химическая природа и спектральные характеристики трех интермедиатов (A,P,O) воспроизводят общие характеристики аналогичных интермедиатов в оксидазах аа3-типа. В то же время, в отличие от оксидаз аа3-типа, интермедиат F в ba3 оксидазе демонстрировал те же спектральные характеристики, что и интермедиат P. По-видимому, перенос протона, принимающего участие в переходе P->F оксидазы bа3-типа, происходит не в биядерный центр, а к редокс-активному остатку тирозина, ковалентно связанному с одним из лигандов CuB. Значение суммарной транслокации зарядов, наблюдающееся на стадии F->O перехода в ba3 оксидазе близко к таковому для аа3 оксидазы в этих же условиях. В тоже время для перехода P->F в ba3 оксидазе характерно значительное снижение относительной амплитуды электрогенной транслокации зарядов, что вероятно является отражением меньшей общей эффективности протонного насоса в данной оксидазе, наблюдающейся в стационарных измерениях.