ИСТИНА

Высокая суммарная концентрация биологических макромолекул в клетке создает условия, которые принято называть условиями макромолекулярного краудинга. Макромолекулярный краудинг ограничивает свободное пространство, поскольку большая часть объема занята макромолекулами, уменьшает количество свободной воды и влияет на свойства растворителя. Очевидно, условия экспериментов, проводимых в сильно разбавленных растворах, далеки от реальных клеточных условий. Условия макромолекулярного краудинга in vitro моделируют высокими концентрациями нейтральных полимерных молекул – «краудинг агентами». Принимая во внимание ограничение доступного исследуемым белкам объема, или эффект исключенного объема, можно предположить, что присутствие краудинг агентов должно приводить к стабилизации компактного нативного состояния белка, а также сдвигать равновесие в сторону олигомерных и агрегированных форм белков. Очевидно, что условия макромолекулярного краудинга будут оказывать существенное влияние на биологические процессы, зависящие от доступного объема, такие как сворачивание белков, агрегация неправильно свернутых белков и образование амилоидных фибрилл и т.п. В настоящей работе мы исследовали влияние нескольких краудинг агентов (полиэтиленгликоля (ПЭГ) различной молекулярной массы (600, 8000 и 12000 Да), Декстрана-70 и Фикола-70) на спектральные свойства и процессы разворачивания – сворачивания супер-фолдера зеленого флуоресцентного белка sfGFP под действием гуанидин тиоцианата (GTC). Показано, что краудинг агенты не оказывают влияния на структуру sfGFP. Однако влияние используемых краудинг агентов на конформационную стабильность sfGFP существенно различается. Присутствие Декстрана-70 и Фикола-70 не приводит к регистрируемому сдвигу денатурационых кривых sfGFP под действием GTC даже при их высокой концентрации. ПЭГ оказывает влияние на конформационную стабильность sfGFP, однако эффект этого краудинг агента зависит от его молекулярной массы и концентрации сложным образом. При концентрации ПЭГ 8% краудинг агент с наибольшей молекулярной массой оказывает дестабилизирующий эффект на структуру sfGFP, а в присутствии двух других ПЭГ устойчивость sfGFP к действию GTC увеличивается. При концентрации 20% ПЭГ оказывает стабилизирующий эффект на структуру sfGFP, возрастающий с увеличением молекулярной массы краудинг агента. В противоположность этому, при наибольшей исследуемой концентрации (30%) ПЭГ меньшей молекулярной массы оказывает наиболее выраженный стабилизирующий эффект на sfGFP. Наши данные свидетельствуют, что классическая теория исключенного объема недостаточна для описания поведения биомолекул в условиях макромолекулярного краудинга. Мягкие взаимодействия между тестируемой молекулой и краудинг агентом могут моделировать эффект исключенного объема, усиливая или ослабляя его. Однако неизменность структуры sfGFP в присутствии всех используемых краудинг агентов свидетельствует о том, в данном случае отсутствует прямое взаимодействие между sfGFP и полимерами. Данные настоящего и ряда других исследований показывают, что краудинг агенты могут дополнительно оказывать существенное влияние на свойства растворителя. Различное моделирование свойств растворителя в значительной степени определяет протекание биологических процессов в густонаселенной клеточной среде.