ИСТИНА

Липополисахариды (ЛПС) являются основным компонентом внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Наличие ЛПС в препаратах медицинского значения не допускается. Существующие на данный момент методы очистки растворов от ЛПС представляют определённые трудности и поиск альтернативного метода избавления от ЛПС является актуальной задачей. Цель данной работы — создание генно-модифицированного штамма E. coli Rosetta2(DE3) с нокаутом нескольких генов, ответственных за начальный этап биосинтеза ЛПС. Задачи. 1) Определить гены-мишени для редактирования в выбранном штамме E. coli. 2) Последовательно провести нокауты выбранных генов-мишеней с помощью системы редактирования генома CRISPR-Cas9. 3) Оценить количество эндотоксинов в препаратах модельного рекомбинантного белка, полученного с использованием промежуточных и конечного мутантных штаммов. Были сконструированы векторы c донорной ДНК, гомологичной целевым локусам генома. Успешность редактирования целевых локусов подтверждалась секвенированием по Сэнгеру. В мутантном и исходном штаммах был наработан рекомбинантный GFP (по три биологических повторности) и далее очищен при помощи металл-хелатной хроматографии. Содержание эндотоксинов в образцах очищенного GFP и лизатов клеток оценивалось качественным методом гель-тромб теста (разновидность ЛАЛ-теста). При этом анализировались серии двукратных разведений белка/лизатов клеток. Выводы. 1) Собраны плазмидные векторы серии pTarget, предназначенные для CRISPR-Cas9-опосредованного геномного редактирования генов kdsD, gutQ, lpxL, lpxM, lpxP, pagP, eptA. 2) На основе E. coli Rosetta 2(DE3) получены промежуточные и конечный нокаутные по генам-мишеням штаммы. 3) По результатам гель-тромб теста содержание эндотоксинов снижено в четыре раза в препаратах рекомбинантного GFP и в восемь раз в лизатах клеток мутантного штамма относительно исходного. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-24-00080, https://rscf.ru/project/23-24-00080/.