ИСТИНА

Сурфактин – циклический гептапептид, этерифицированный жирной кислотой. Он являетсяхорошо исследованным и востребованным биологическим поверхностно-активнымвеществом (биоПАВ). Преимущества сурфактина по сравнению с синтетическими ПАВ –биологическая совместимость, экологическая безопасность, низкая токсичность. Сурфактин,полученный микробиологическим синтезом, является смесью нескольких изоформ,отличающихся между собой длиной углеводородной цепи в остатке жирной кислоты (С13,С14, С15) и аминокислотным составом. На сегодняшний день используют два основныхинструмента повышения продукции биоПАВ – оптимизация условий культивирования(добавление ионов металлов, рост на углерод-богатой среде, варьирование источников азотаи углерода, изменение температуры, pH, степени аэрации и др.) и аппарат генной инженерии– постановка генов, отвечающих за биосинтез SF, под сильный промотор, нокаут генов,конкурирующих за клеточные ресурсы, суперэкспрессия генов эффлюкса сурфактина имногое другое. В одной из наиболее полных работ, посвященных получению генно-модифицированного суперпродуцента сурфактина, количество продуцируемого веществасоставило 12,8 г/л культуральной среды, что является одним из максимальных показателей.Относительное количество мРНК генов оперона srfA в клетках измеряли с помощьюколичественной ПЦР с обратной транскрипцией, количество продуцируемого сурфактинаисследовали с помощью колориметрического метода, основанного на образовании комплексабромтимоловый синий-сурфактин, данные валидировали ВЭЖХ. Интактный ген sfp вносилис помощью плазмиды, нарабатываемой в E. coli, контроль внесения плазмиды с геном –метод ПЦР с бактериальных колоний. Высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, аминокислотный анализ. Объекты исследования: клетки B. subtilisприродного штамма NCIB 3610 и лабораторного штамма PY79. Лабораторный штамм PY79не способен к биосинтезу сурфактина из-за мутации в гене sfp, хотя содержит ряд мутаций, сбольшой долей вероятности способствующих биосинтезу сурфактина. Перспективнымявляется восстановление сурфактин-синтезирующей активности данного штамма. Нокаутгена 6S-1 РНК в клетках Bacillus subtilis приводит к повышению эффективноститранскрипции всех генов оперона srfA, кодирующего фермент сурфактинсинтетазу, в позднейстационарной фазе клеточного роста. Однако количество синтезируемого клетка В результатепроверки влияния малой некодирующей 6S-2 РНК на процесс биосинтеза сурфактина вклетках B. subtilis мы показали, что делеция гена 6S-2 РНК в бактериях B. subtilis штаммовPY79 и NCIB 3610 в отличие от гена 6S-1 РНК не приводит к повышению эффективноститранскрипции генов srfAA, srfAB и srfAC и srfAD входящих в состав кодирующегосубъединицы сурфактинсинтетазы оперона srfA. Количество продуцируемого сурфактинаклетками B. subtilis NCIB 3610 при этом не изменяется. Двойная делеция генов обеих малыхнекодирующих 6S РНК не приводит к изменению эффективности транскрипции оперона srfAв клетках B. subtilis NCIB 3610, однако количество продуцируемого SF уменьшается вдвое.Для штамма PY79 показано увеличение эффективности транскрипции оперона srfA придвойной делеции, что может быть эффектом от делеции гена 6S-1 РНК, показанным ранее. Спомощью экспрессионной плазмиды c интактным геном sfp нами была восстановленасурфактин-продуцирующая активность клеток штамма PY79, количество продуцируемого SFоказалось вдвое больше, чем продуцировали клетки штамма NCIB 3610. Причем количествосурфактина было одинаковым для всех клеточных линий. Данная гипотеза может быть194объяснена влиянием делеции генов 6S РНК на эффективность транскрипции генов,конкурирующих с процессом биосинтеза cурфактина за клеточные ресурсы. Более того,показано отсутствие влияния индуктора ИПТГ на количество продуцируемого вещества. Дляподробного анализа отсутствия эффекта от делеции 6S-1 РНК на количество продуцируемоговещества, несмотря на увеличение эффективности транскрипции оперона srfA, былаисследована транскрипция генов, кодирующих ферменты, субстратом которых является Glu –аминокислота, с которой начинается биосинтез сурфактина в клетках B. subtilis. Оказалось,что количество мРНК глутаматдегидрогеназы – фермента, катализирующего реакциюпревращения Glu в 2-оксоглутарат, в клеточной линии с нокаутом 6S-1 РНК увеличенопримерно в 20 раз по сравнению с клетками дикого типа. Данный эффект приводит кпонижению количества доступного Glu в клетке для биосинтеза SF, что, в свою очередь,нивелирует эффект делеции 6S-1 РНК на увеличение транскрипции оперона srfA. Приклеточном росте на среде, богатой глутаматом, оказалось, что количество синтезируемогосурфактина понижается, что может быть связано с активацией регуляторного пути CodY,поскольку данная система ингибирует активность оперона srfA при большом количествеаминокислот в среде. Однако данный эффект требует дальнейшего изучения, посколькурегуляторная система биосинтеза сурфактина в клетках B. subtilis достаточно сложна ивключает в себя сразу несколько различных путей. Таким образом, недостаток Glu в клетке иингибирование биосинтеза SF в глутамат-богатой среде может быть не единственнойпричиной отсутствия увеличения количества продуцируемого вещества. Также в даннойработе изучен качественный состав сурфактина, продуцируемого клетками штаммов NCIB3610 и PY79 дикого типа. Показано, что основной изоформой для клеток обоих штаммовявляется C15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu. В дальнейшем планируется сравнение составасурфактина, продуцируемого нокаутными клеточными линиями для поиска взаимосвязисостава и делеции генов 6S-РНК как по одному, так и двойной.