ИСТИНА

Буферы Гуда, представляют собой цвиттерионные соединения, поддерживающие рН растворов близкими к таковым для биологических сред. Это важно, поскольку рН влияет на электростатические взаимодействия между заряженными группами натуральных белков, и его изменение может привести к потере биологической активности. Эти цвиттерионные соединения, описанные и протестированные Норманом Гудом лишь в конце прошлого века, широко используются в микробиологии, биохимии, фармакологии и биотехнологии, в частности для разделения и выделения различных биологических субстанций. Определенную проблему представляет присутствие микроколичеств этой группы соединений в чистых препаратах. Однако, в научной литературе отсутствуют методики простого и надежного способа определения буферов Гуда, что явилось целью настоящего исследования. Структура молекул и свойства буферов Гуда схожи с аминокислотами. В водных растворах молекулы буферов Гуда являются цвиттер-ионами, то есть обладают способностью протонироваться в кислых и депротонироваться в щелочных средах, поэтому для их разделения можно использовать катионообменный или анионообменный варианты ЖХ. Первоначально, для оценки ионного состояния аналитов и выбора рабочих значений рН были построены диаграммы распределения ионных форм по заряду. Изучены различные варианты хроматографического разделения 10 различных буферов Гуда на сильно- (С1Р, 100x4,6 мм, 5 мкм, Аквилон) и слабокислотном (С12Р, Портлаб) катионообменных сорбентах. В оптимальных условиях на колонке с сульфокатионообменником получено разделение модельной смеси из пяти компонентов. Также рассмотрены возможности разделения буферов Гуда на слабоосновном (Zorbax NH2, 250 х 4.6 мм, 5 мкм, Agilent) и сильноосновном (PRP-X100, 150 х 4.6 мм, 5 мкм, Hamilton) анионообменниках. Наиболее селективное разделение достигнуто при использовании сильноосновной анионообменной колонки PRP-X100 на основе сополимера стирола и дивинилбензола с триметиламмониевыми функциональными группами, на которой при использовании карбонатного элюента получено разделение семи компонентов буферов Гуда. Были исследованы возможности кондуктометрического и спектрофотометрического детектирования буферов Гуда. Сравнительный анализ спектров поглощения показал более высокую чувствительность спектрофотометрического детектирования в щелочных элюентах, что подтвердило перспективность использования спектрофотометрического детектирования в низковолновой области спектра при 215 нм в щелочных элюентах. Для трех буферов Гуда (HEPES, TAPS, BICINE) построены градуировочные зависимости, рассчитаны метрологические характеристики, определены пределы обнаружения, составляющие (1-3)х10-6 моль/л.