ИСТИНА

Получение флуоресцентных белков с высоким временем жизни флуоресценции является важной задачей для развития методов на основе времяразрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) и Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET). Время жизни флуоресценции большинства зеленых флуоресцентных белков находится в диапазоне 1.5 - 3 нс. Исключение составляет недавно полученный в нашем коллективе белок NowGFP с анионным хромофором на основе триптофана, характеризующийся временем жизни около 5 нс. Модельные FRET-пары на основе NowGFP обладают наибольшим Ферсторовским радиусом среди всех опубликованных FRET-пар на основе флуоресцентных белков. Однако NowGFP обладает низкой фотостабильностью из-за эффективной фотоконверсии, сопровождающейся декомпозицией боковой цепи лизина 61 и переходом хромофора в нейтральное состояние. В данном проекте в качестве основы для мутагенеза мы использовали голубой флуоресцентный белок mTurquoise2, характеризующийся очень высоким квантовым выходом флуоресценции (0.93) и высоким временем жизни флуоресценции (4 нс). Для сдвига спектров флуоресценции в зеленую область была введена замена T203Y, которая приводит к батохромному сдвигу за счет стекинга тирозина 203 с хромофором, а не за счет депротонирования последнего. Последующий случайный мутагенез позволил получить улучшенные варианты с временем жизни флуоресценции до 4.8 нс и достаточно высокой фотостабильностью, сопоставимой с таковой белка EGFP. Мы считаем, что полученные флуоресцентные белки могут быть потенциально использованы для многопараметрической FLIM микроскопии в зеленом канале детекции (совместно с другими зелеными флуоресцентными белками с меньшим временем жизни), а также в качестве FRET-доноров для оранжевых и красных флуоресцентных белков для детекции белок-белковых взаимодействий и создания FRET-сенсоров.